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文檔簡介
1、一般認為,在植物病毒侵染宿主植株以后,主要是通過破壞細胞葉綠體結(jié)構(gòu)進而影響葉綠素的積累和光合作用。本課題組前期的實驗表明,百合無癥病毒(Lily SymptomlessVirus,LSV)單獨感染百合植株外部癥狀不明顯,且宿主植物生理指標、光合作用、葉綠體超微結(jié)構(gòu)等受影響程度與百合斑駁病毒(Lily mottle virus,LMoV)感染相比危害較輕,為了證明LSV是否存在于葉綠體中,本研究通過對感染LSV的植株進行葉綠體提取、葉綠體
2、總蛋白的提純以及外殼蛋白(Coat Protein,CP)在葉綠體積累的分子檢測三方面研究,以期弄清LSV的作用位點,進一步闡明LSV的致病機理。
本研究分別以感染LSV和健康對照的東方百合“索邦”(Lilium oriental,'Sorbonne')的葉片為材料。LSV粒子的分離純化首先采用PEG沉淀法粗提,然后采用蔗糖密度梯度離心法進一步分離純化。通過電鏡觀察以及酶標儀分析,發(fā)現(xiàn)采用PEG沉淀法粗提病毒粒子濃度較低且雜質(zhì)
3、很多,而采用蔗糖密度梯度離心提純法進一步提純后,得到的LSV粒子濃度較高且雜質(zhì)較少。LSV提純粒子的OD260/OD280為1.331,符合純品標準。所得LSV提純粒子的濃度為0.328 mg/mL,產(chǎn)量為鮮重每克葉片可提純病毒粒子14.53μg。
采用緩沖液抽提法和酶解法分別提取葉綠體,并對各自反應(yīng)條件進行優(yōu)化。緩沖液抽提法的優(yōu)化方案如下:在抽提緩沖液中加入5%山梨醇,2500r/min蔗糖密度梯度離心獲得的葉綠體產(chǎn)量最高,
4、鮮重每克葉片完整葉綠體的葉綠素提取量為130.4mg。酶解法的優(yōu)化方案如下:4℃低溫處理百合葉片24h,向CPW鹽溶液中加入0.5%果膠酶、20mmol/L MES、0.6mol/L甘露醇和1%纖維素酶酶解5h,得到葉綠體產(chǎn)量最高,鮮重每克葉片完整葉綠體的葉綠素提取量為182.7mg。將兩種優(yōu)化的方案結(jié)合起來,形成一套綜合提取方案,以此種方法進行葉綠體提取,鮮重每克葉片完整葉綠體的葉綠素提取量為191.1mg。因此,綜合法是提取百合完整
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