NDRG2對(duì)腫瘤細(xì)胞糖代謝抑制作用的研究.pdf

1、三大代謝途徑之一的糖代謝是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要代謝途徑。在正常細(xì)胞中，葡萄糖是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的主要能源物質(zhì)。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞具有增殖活躍，生長(zhǎng)迅速，能量需求大的特點(diǎn)。作為主要能源物質(zhì)的葡萄糖對(duì)于腫瘤細(xì)胞來說具有更加重要的功能，因此干預(yù)腫瘤細(xì)胞中的葡萄糖代謝必然會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生重大影響。
　　人源NDRG2基因（也叫SYLD/KIAA1248）是NDRG家族成員之一，由我校生化教研室于1999年利用錨定引物PCR法從正常人

2、腦的cDNA文庫中克隆得到的一個(gè)新基因[GeneBank登錄號(hào)AF159092]。其染色體定位于14q11.2，含有16個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子；mRNA全長(zhǎng)為2024bp，編碼含有357個(gè)氨基酸殘基、分子量約為41kDa的蛋白質(zhì)。其組織學(xué)分布研究結(jié)果顯示，該基因在人體多種正常組織呈高表達(dá)，而在某些腫瘤組織中則低表達(dá)或不表達(dá)。從而推測(cè)NDRG2可能是一種新的腫瘤抑癌基因。近年來世界上各研究組相繼開展了大量關(guān)于NDRG2的研究，結(jié)果顯示，N

3、DRG2可以影響細(xì)胞的分化[1]，參與阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展[2]，在大鼠的腎集合管內(nèi)通過調(diào)節(jié)鹽皮質(zhì)激素來調(diào)節(jié)鈉鹽的代謝[3]，由Akt和PKC磷酸化的NDRG2蛋白可參與胰島素的信號(hào)通路[4]。Wielpütz[5]等人發(fā)現(xiàn)NDRG2可能影響非洲光滑爪蟾卵母細(xì)胞和大鼠甲狀腺細(xì)胞內(nèi)的鈉通道上皮細(xì)胞的功能，增加卵母細(xì)胞膜上的電流量，誘導(dǎo)細(xì)胞表面鈉通道的表達(dá)。同時(shí)，生化教研室李燕博士的課題發(fā)現(xiàn)NDRG2可以影響小鼠唾液腺細(xì)胞Na+-K+-

4、ATP酶的活性和表達(dá),這些有研究結(jié)果提示我們，NDRG2的作用不僅局限在某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控的通道上，還可能參與到細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸過程中。
　　那么NDRG2是否會(huì)影響腫瘤細(xì)胞葡萄糖的攝取從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)呢？帶著這樣的疑問，我們進(jìn)行了以下四部分實(shí)驗(yàn)：篩選NDRG2差異表達(dá)的細(xì)胞系；檢測(cè)高糖、低糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NDRG2表達(dá)的改變對(duì)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度的影響；探索NDRG2影響腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖的機(jī)制。
　　1.通過

5、Westernblotting方法我們觀察了NDRG2在多種乳腺癌細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，經(jīng)過篩選，我們選取SK-BR-3細(xì)胞、T-47D細(xì)胞、HHCC和HepG2細(xì)胞細(xì)胞作為研究對(duì)象開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.用高糖、低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度，結(jié)果顯示高糖與低糖環(huán)境中的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平有明顯的差異。用MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下的細(xì)胞生長(zhǎng)較低糖環(huán)境下的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。

6、>　　3.分別轉(zhuǎn)染NDRG2siRNA和NDRG2重組腺病毒，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)干預(yù)NDRG2的表達(dá)后，利用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)高糖、低糖環(huán)境中的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度，結(jié)果顯示高糖環(huán)境中的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度隨NDRG2的改變發(fā)生明顯的變化，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NDRG2水平升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度降低，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NDRG2水平降低時(shí)，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度升高；而低糖環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度未隨NDRG2的改變而發(fā)生明顯的變化。
　　4.哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的葡萄糖轉(zhuǎn)

7、運(yùn)載體GLUT1定位在細(xì)胞的質(zhì)膜上，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，作為腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖的門戶分子發(fā)揮著重要作用。有研究表明，NDRG2可以影響細(xì)胞膜上的某些轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能[5]，具有調(diào)節(jié)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。為了探索NDRG2調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞糖代謝功能的機(jī)制，我們大膽假設(shè)NDRG2可能通過影響GLUT1來影響腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，進(jìn)而影響了腫瘤細(xì)胞的糖代謝狀態(tài)。在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上我們將細(xì)胞轉(zhuǎn)染NDRG2siRNA后利用Real-timePCR方法和W

8、estern-blotting方法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GLUT1mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLUT1mRNA水平和蛋白質(zhì)水平并未因NDRG2水平的變化而變化。表明NDRG2不影響GLUT1的表達(dá)。但利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)NDRG2和GLUT1存在共定位。進(jìn)一步采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者在細(xì)胞內(nèi)有直接的結(jié)合。這些結(jié)果提示NDRG2可能通過與GLUT1的直接結(jié)合結(jié)合影響后者的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位、功能或降解過程，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)葡

9、萄糖的攝取，最終對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。
　　綜上所述，我們首次證實(shí)了NDRG2與腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝密切相關(guān)。在這個(gè)過程中，NDRG2通過抑制腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖起到抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用。在進(jìn)一步的研究中我們證實(shí)細(xì)胞內(nèi)NDRG2與GLUT1存在直接的相互作用，這種相互作用影響了GLUT1的功能，進(jìn)而影響了腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。因此我們推測(cè)NDRG2對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制很可能是通過與GLUT1的直接相互作用而實(shí)現(xiàn)的。這為N