Cajal間質(zhì)細(xì)胞與先天性巨結(jié)腸病的相關(guān)性研究.pdf

1、無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸?。╝ganglionic megacolon）又稱Hirschsprung氏病（Hirschsprung's disease，HD），是一種嚴(yán)重危害嬰幼兒健康的先天性畸形，據(jù)統(tǒng)計，其發(fā)病率高達(dá)1/3000～1/5000，居消化道畸形第二位。先天性巨結(jié)腸的主要病理變化是一段結(jié)腸壁內(nèi)缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，致使該段結(jié)腸持續(xù)性痙攣，腸腔狹窄，其近端腸腔擴(kuò)張，內(nèi)容物潴留。目前，有關(guān)先天性巨結(jié)腸的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為該

2、病屬于多因子遺傳性疾病，即由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致。先天性巨結(jié)腸的主要臨床表現(xiàn)是腹脹、頑固性便秘、不完全性腸梗阻。目前臨床上唯一有效的治療方法是手術(shù)，但由于手術(shù)損傷比較大和結(jié)腸縮短，術(shù)后常出現(xiàn)小腸結(jié)腸炎、稀便、患兒心理障礙等后遺癥。因此，有人嘗試進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞移植治療無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的實驗研究，即用各種來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植入缺少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病變腸壁內(nèi)。雖然移植進(jìn)去的神經(jīng)干細(xì)胞可以在腸壁的微環(huán)境中存活，并分化為功能性的腸神經(jīng)細(xì)

3、胞，但只是部分恢復(fù)了無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段的運(yùn)動功能。這說明在先天性巨結(jié)腸的發(fā)病機(jī)制中除了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如之外，還有其他因素的參與，其中腸壁中的Cajal間質(zhì)細(xì)胞引起了人們的關(guān)注。 Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）是分布在胃腸道內(nèi)由中胚層間充質(zhì)細(xì)胞分化而來的一類細(xì)胞，由西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal在1893年首次描述。它既不是神經(jīng)元，也不是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，更不是平滑肌細(xì)胞，而是具有獨(dú)立

4、功能的特殊間質(zhì)細(xì)胞。目前Cajal間質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性和特殊功能越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，這類細(xì)胞是胃腸道平滑肌的起搏細(xì)胞，能產(chǎn)生生理慢波，并參與電活動的擴(kuò)布，從而調(diào)控胃腸道平滑肌的舒縮和蠕動，其數(shù)量減少或缺失與多種胃腸動力性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。先天性巨結(jié)腸病屬胃腸動力性疾病之一，Cajal間質(zhì)細(xì)胞的異常與先天性巨結(jié)腸的發(fā)病也必然存在一定的相關(guān)性。揭示Cajal間質(zhì)細(xì)胞的異常與先天性巨結(jié)腸病發(fā)病的相關(guān)關(guān)系，可進(jìn)一步闡明無神經(jīng)

5、細(xì)胞性巨結(jié)腸病的發(fā)病機(jī)理，并為先天性巨結(jié)腸病的細(xì)胞替代治療提供實驗依據(jù)。 根據(jù)上述理念，我們對Cajal間質(zhì)細(xì)胞與先天性巨結(jié)腸病的相關(guān)性進(jìn)行了比較深入的研究，論文發(fā)表于Neuroscience Letters雜志，實驗分為三個部分： 第一部分大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 為了更好地從形態(tài)上識別Cajal間質(zhì)細(xì)胞和利用特異性表面抗原準(zhǔn)確地鑒別Cajal間質(zhì)細(xì)胞，從而為下一步的研究奠定基礎(chǔ)，我們對大鼠結(jié)腸壁

6、內(nèi)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分離和體外培養(yǎng)。體外細(xì)胞培養(yǎng)，是研究細(xì)胞功能以及相應(yīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的基礎(chǔ)，也有利于更深入地掌握疾病本質(zhì)，制定合理有效的防治措施。但是由于Cajal間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量少，分散在結(jié)締組織、神經(jīng)纖維及平滑肌等組織之中，分離提取的難度較大。對于這類細(xì)胞的體外培養(yǎng)，由于無這樣的經(jīng)驗可循，因而難度更大。我們采用膠原酶及胰酶酶解和密度梯度離心法，經(jīng)過多次調(diào)配兩種酶的濃度和作用時間，成功地對Cajal間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分離。分離出

7、細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液接種于含有干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）的M199培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，ICCs即可貼壁生長，培養(yǎng)3天后，可分辨出ICCs形態(tài)，胞體呈三角形或梭形，有少量突起，核大。培養(yǎng)5天后，ICC形態(tài)更為清晰，自胞體發(fā)出的突起向周圍伸長，相鄰細(xì)胞胞體伸出的突起相互靠近。培養(yǎng)7天后，相鄰ICC突起間有連接形成，細(xì)胞間彼此聯(lián)系，突起相互交織，形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，用Cajal間質(zhì)細(xì)胞的特

8、異性標(biāo)志物c-kit進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示Cajal間質(zhì)細(xì)胞呈陽性著色。 第二部分小兒結(jié)腸壁內(nèi)Cajal間質(zhì)細(xì)胞的正常分布模式的檢測 研究表明，從小鼠的胚胎時期直至出生后，Cajal間質(zhì)細(xì)胞在胃腸道內(nèi)有一個不斷發(fā)育成熟的過程，并形成不同的亞型。根據(jù)Cajal間質(zhì)細(xì)胞在胃腸道內(nèi)分布部位的不同，通常將其分為三個亞型，即位于腸壁粘膜下層的粘膜下ICCs，稱為IC-SM；位于縱行肌與環(huán)形肌之間的肌間ICCs，稱為IC-M

9、Y；位于肌層內(nèi)的肌內(nèi)ICCs，稱為IC-IM。有關(guān)小兒結(jié)腸壁內(nèi)的三種亞型的Cajal間質(zhì)細(xì)胞的正常分布狀況及其功能至今仍未見報道?；诖?，我們收集臨床手術(shù)切除的小兒正常結(jié)腸標(biāo)本，用小鼠抗人c-kit單克隆抗體（CD117）作標(biāo)記，免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡檢測了結(jié)腸標(biāo)本冰凍切片中ICCs的分布狀況，觀察了三種亞型的ICCs在小兒正常結(jié)腸壁中的分布狀況，結(jié)果顯示肌間ICCs（IC-MY）含量最為豐富，呈網(wǎng)絡(luò)狀包繞在肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞周圍，肌

10、層內(nèi)ICCs（IC-IM）數(shù)量也較多，與平滑肌細(xì)胞平行分布，粘膜下ICCs（IC-SM）的數(shù)量最少。用兔抗人nNOS多克隆抗體標(biāo)記NOS神經(jīng)，免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡檢測了標(biāo)本冰凍切片及腸壁鋪片中NOS神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的分布情況，結(jié)果顯示，在縱行肌和環(huán)形肌之間，NOS陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，肌層內(nèi)也有較多的NOS陽性神經(jīng)纖維平行于平滑肌細(xì)胞分布。應(yīng)用c-kit與nNOS雙重染色檢測了結(jié)腸壁中ICCs和NOS陽性神經(jīng)元及神

11、經(jīng)纖維的位置關(guān)系，結(jié)果顯示，NOS陽性神經(jīng)纖維與ICCs之間密切接觸，ICCs與平滑肌細(xì)胞的接觸也很密切。上述實驗結(jié)果提示，小兒結(jié)腸壁內(nèi)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞已形成正常的規(guī)律性分布，并與腸神經(jīng)及平滑肌之間存在著密切接觸，可能由此形成腸壁規(guī)律性舒縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 第三部分 Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸病中的異常變化 選擇確診為先天性巨結(jié)腸的患兒21例，其中普通型巨結(jié)腸16例，全結(jié)腸型巨結(jié)腸（TCA）5例，取巨結(jié)腸根治術(shù)標(biāo)本

12、痙攣段全層腸壁作為實驗組，另取7例正常結(jié)腸相應(yīng)節(jié)段標(biāo)本作為對照組，冰凍切片，片厚10μm。用小鼠抗人c-kit單克隆抗體（CD117）作標(biāo)記，免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡檢測了實驗組及對照組結(jié)腸標(biāo)本冰凍切片中ICCs的分布狀況，結(jié)果顯示，與正常組結(jié)腸相比，實驗組各結(jié)腸標(biāo)本中三種亞型的ICCs（IC-MY，IC-IM，IC-SM）數(shù)量均明顯減少，有顯著差異（P<0．01），與普通型巨結(jié)腸相比，肌間ICCs（IC-MY）在全結(jié)腸型巨結(jié)腸中的

13、數(shù)量減少更為明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0．01），而粘膜下ICCs（IC-SM）和肌內(nèi)ICCs（IC-IM）的分布則無明顯差異性（P>0．05）。用兔抗人nNOS多克隆抗體標(biāo)記NOS神經(jīng)，免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡檢測了兩組標(biāo)本冰凍切片及腸壁鋪片中NOS神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的分布情況，結(jié)果顯示，實驗組NOS陽性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少，甚至缺失，與對照組相比，差異顯著（P<0．01）。應(yīng)用c-kit與nNOS免疫熒光雙重染色，檢測了兩組

14、標(biāo)本冰凍切片中ICCs和NOS陽性神經(jīng)的位置關(guān)系，結(jié)果顯示NOS陽性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維與ICCs位置疏遠(yuǎn)，無密切接觸。同時，我們還將收集到的結(jié)腸標(biāo)本的肌層，勻漿后提取總RNA和蛋白，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR），在mRNA水平上檢測正常結(jié)腸和HD痙攣段結(jié)腸c-kit基因、nNOS基因與看家基因GAPDH的表達(dá)，用Western blo

15、t方法檢測兩組標(biāo)本中c-kit蛋白及nNOS蛋白的表達(dá)，對實驗結(jié)果條帶進(jìn)行半定量分析，結(jié)果證實，先天性巨結(jié)腸病變腸壁內(nèi)c-kit蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低（P<0．01），nNOS蛋白與mRNA表達(dá)也明顯減少（P<0．01）。以上實驗結(jié)果提示，無神經(jīng)節(jié)性巨結(jié)腸病患兒病變段結(jié)腸壁內(nèi)三種亞型的Cajal間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少甚至缺失，病變段腸管必然喪失產(chǎn)生電慢波的能力，同時NOS陽性神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的數(shù)量也明顯降低，導(dǎo)致或加劇了巨結(jié)腸病變段

16、腸管的功能紊亂。 結(jié)論： 1、本課題成功地對Wistar大鼠結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了分離和體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)的ICCs可以形成獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，從而為這種細(xì)胞的深入研究提供技術(shù)支持。 2、小兒結(jié)腸壁內(nèi)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞和NOS陽性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，具有了調(diào)控結(jié)腸運(yùn)動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，肌間神經(jīng)叢中NOS陽性神經(jīng)元與肌間ICCs（IC-MY）關(guān)系密切，NO能神經(jīng)可能對肌間ICCs（IC-MY）起調(diào)節(jié)作用。