pAd-PPARγ重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建針對(duì)PPARγ基因的重組腺病毒載體 pAdEasy-1-PPARγ-pShuttle-CMV(簡(jiǎn)寫pAd-PPARγ)并對(duì)其進(jìn)行包裝,擴(kuò)增,純化及滴度檢測(cè),為PPARγ參與血管內(nèi)皮胰島素抵抗的調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　?、貶UVECs細(xì)胞中提總RNA;
　?、谟萌浇鹉孓D(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
　?、跴CR擴(kuò)增目的片段PPARγ;
　　④構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒PPARγ-

2、pShuttle-CMV;
　?、輰⒅亟M穿梭質(zhì)粒PPARγ-pShuttle-CMV與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在菌株BJ5183中同源重組;
　?、拗亟M腺病毒載體pAdEasy-1-PPARγ-pShuttle-CMV(pAd-PPARγ)的包裝、擴(kuò)增、純化及病毒滴度檢測(cè);
　　⑦pAd- PPARγ感染HUVECs后PPARγ表達(dá)檢測(cè)
　　結(jié)果:
　?、?PCR結(jié)果:從HUVECs細(xì)胞中提取總RN

3、A,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,在1％的瓊脂糖凝膠電泳后在1433bp附近處有亮帶,說明成功擴(kuò)增出PPARγ DNA目的片段;
　?、谥亟M穿梭質(zhì)粒PPARγ-pShuttle-CMV酶切鑒定結(jié)果:將重組穿梭質(zhì)粒PPARγ-pShuttle-CMV經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后電泳應(yīng)在約7500bp位置和約1400bp位置各有一條亮帶;
　?、壑亟M穿梭質(zhì)粒PPARγ-pShuttle-CMV測(cè)序鑒定結(jié)果:經(jīng)測(cè)序鑒定,以pShuttle-

4、CMV質(zhì)粒通用引物為測(cè)序引物,共測(cè)約1400個(gè)堿基,經(jīng)比對(duì)與GenBank上公布的序列一致;
　　④重組腺病毒載體pAd-PPARγ酶切鑒定:將重組的穿梭質(zhì)粒PPARγ-pShuttle-CMV與含有腺病毒骨架質(zhì)粒的pAdEasy-1在BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行同源重組,經(jīng)PacⅠ單酶切后電泳條帶應(yīng)在約30Kb和4.5Kb附近有兩條帶,說明重組成功;
　?、葜亟M腺病毒載體pAd-PPARγ包裝與擴(kuò)增:經(jīng)PacⅠ限制性內(nèi)切酶

5、單切pAd-PPARγ,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝與擴(kuò)增,得到一定滴度的病毒液,病毒包裝成功后,細(xì)胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象,細(xì)胞變圓脫落,出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),說明病毒包裝基本完成;
　?、拗亟M腺病毒載體pAd-PPARγ病毒滴度檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)擴(kuò)增純化,采用TCID50方法檢測(cè),其TCID50為10-6.7/mL,達(dá)到感染真核細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn),病毒滴度較滿意;
　?、遬Ad-PPARγ感染HUVECs后PPARγ表達(dá)