大鼠5-HT-,5A-受體基因siRNA重組腺病毒表達載體的構建與表達.pdf

1、背景與目的： 5-羥色胺5A受體是5-羥色胺受體家族中的一個亞型，是主要定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種G蛋白偶聯(lián)受體。在對小鼠、大鼠和人mRNA的定位研究顯示5-HT5A受體mRNA在腦組織中廣泛表達，但在外周組織的表達很低甚至不表達。5-HT5A受體的分布區(qū)域與認知、焦慮的調(diào)節(jié)、感覺的形成、神經(jīng)內(nèi)分泌、運動的整合、晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)及疼痛的調(diào)控有關。雖然5-HT5A受體被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過10年，但是目前國內(nèi)外少有對5-HT5A受體功能的深入

2、研究。這主要是因為缺乏針對5-HT5A受體的高選擇性配體和拮抗劑，因此很難界定5-HT5A受體在生理和病理過程中所發(fā)揮的作用。因此本實驗構建了以5-HT5A受體基因為靶標的siRNA表達載體，并觀察其在大鼠神經(jīng)細胞中的表達，為在動物體內(nèi)進一步研究該受體的功能提供了技術支持。 研究方法： 1.設計并構建了針對5-HT5A受體mRNA的3條siRNA質粒表達載體pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr

3、5a2、pGenesil-2 Htr5a3和一條無關對照序列表達載體pGenesil-2 HK，同時還構建了一條攜帶有5-HT5A受體全長基因并同時表達紅色和綠色熒光蛋白的質粒表達載體pDsRed-EGFP-Htr5a。分別將pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3、pGenesil-2 HK質粒表達載體與pDsRed-EGFP-Htr5a質粒表達載體共轉染293細胞，4

4、8小時后進行流式細胞篩選，通過用Red紅色熒光做對照，EGFP綠色熒光為主要熒光，看干擾序列對EGFP的減弱程度，從而鑒定出相應的干擾序列對基因的干擾效果，對EGFP減弱程度越明顯，說明干擾效果越明顯。 2.將篩選出的pGenesil-2 Htr5a2表達載體中的Htr5a2表達框亞克隆至pGenesil1.2構建pGenesil1.2 Htr5a2質粒表達載體，然后將pGenesil1.2 Htr5a2與pGSadeno腺病毒

5、表達載體進行同源重組，構建pGSadeno Htr5a2重組腺病毒表達載體，將其轉染293細胞進行包裝出毒并進一步放大培養(yǎng)以獲得需要的病毒量。將收獲的pGSadeno Htr5a2重組腺病毒轉染原代培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)細胞，48小時后用RT-PCR技術檢測各組神經(jīng)細胞內(nèi)5-HT5A受體mRNA的表達情況。 結果： 1.經(jīng)酶切鑒定及DNA測序，重組質粒中已插入了目的基因片段。經(jīng)流式細胞檢測，通過比較GFP平均熒光強度與RFP平均

6、熒光強度的比值，就能篩選出最有效的序列。其中pGenesil-2 Htr5a2的GFP平均熒光強度/RFP平均熒光強度的值為0.39，pGenesil-2 Htr5al的值為0.539，pGenesil-2 Htr5a3的值為0.417，pGenesil-2 HK的值為1.626，由此可知pGenesil-2 Htr5a2能有效抑制5-HT5A受體基因的表達。 2.通過酶切鑒定，證明了目的基因片段正確插入了pGSadeno腺病毒

7、載體中。由于pGSadeno Htr5a2重組腺病毒中有綠色熒光蛋白真核表達框，因此在轉染細胞后如果出現(xiàn)明顯的綠色熒光蛋白表達，則說明有感染能力的重組腺病毒包裝成功，而且經(jīng)測定腺病毒滴度達到109 pfu/ml。將pGSadeno Htr5a2重組腺病毒轉染神經(jīng)細胞后24小時可以觀察到綠色熒光蛋白的表達，48小時后經(jīng)RT-PCR技術檢測pGSadeno Htr5a2重組腺病毒能有效抑制5-HT5A受體mRNA的表達。 結論：

8、 1.成功構建了和鑒定了針對5-HT5A受體基因的RNA干擾重組質粒表達載體pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3，并發(fā)現(xiàn)pGenesil2-Htr5a2能有效抑制外源性5-HT5A受體基因在293細胞中的表達，從而篩選出最有效的重組質粒表達載體，為下一步構建針對5-HT5A受體基因的siRNA重組腺病毒表達載體做好了準備。 2.成功構建了和鑒定了針對5-H