狂犬病病毒M蛋白與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的功能性位點(diǎn)鑒定.pdf

1、狂犬病病毒可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變，造成全球每年死亡人數(shù)高達(dá)70，000人，死亡率極高。目前沒有特效藥治療狂犬病，只能通過接種疫苗來預(yù)防狂犬病病毒的感染。
　　狂犬病病毒是單股負(fù)鏈不分節(jié)段的的RNA病毒，編碼N、P、M、G和L五個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，病毒RNA與N、P、L蛋白緊密結(jié)合在一起共同組成病毒的核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，是病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的活性中心。
　　本研究以廣西街毒株GX01株為研究對象，以固定弱毒株RC-HL為模板，

2、研究GX01株M基因的生物學(xué)特性。在此前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)GX01株M蛋白可以抑制病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并找到引起這種抑制作用的關(guān)鍵位點(diǎn)是M44和M46，當(dāng)對RC-HL的M蛋白進(jìn)行F44L或F44L/S46G聯(lián)合突變時(shí)，可顯著抑制病毒的轉(zhuǎn)錄及在細(xì)胞間的傳播性，但S46G的變異可增強(qiáng)病毒的轉(zhuǎn)錄過程。
　　為闡述產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以rRC-HL(GX01M)為模板，將GX01株M蛋白44、46位氨基酸突變成RC-HL株相應(yīng)位點(diǎn)的氨

3、基酸，得到重組病毒rRC-HLM(L44F)、rRC-HLM(G46S)和rRC-HLM(L44F/G46S)株，對其進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定，檢測病毒的多步生長曲線、蛋白表達(dá)量以及mRNA水平，發(fā)現(xiàn)rRC-HLM(L44F)株的轉(zhuǎn)錄和M蛋白表達(dá)水平與親本株rRC-HL相近，病毒的生長繁殖得到恢復(fù);但拯救的rRC-HLM(G46S)株的轉(zhuǎn)錄和M蛋白表達(dá)水平稍低于rRC-HL(GX01M)株，說明G46S突變可輕微抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄;雙突變株

4、rRC-HLM(L44F/G46S)的轉(zhuǎn)錄和M蛋白表達(dá)水平稍高于rRC-HL(GX01M)株，病毒的生長繁殖有所提高，這與之前本實(shí)驗(yàn)小組得出的結(jié)論相符，結(jié)果可信。
　　rRC-HL(F44L/S46G)株可顯著下調(diào)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄水平，影響病毒的生長，推測與S46潛在磷酸化位點(diǎn)有關(guān)，所以構(gòu)建并拯救去磷酸化突變株rRC-HL(F44L/S46A)，模擬磷酸化的突變株rRC-HL(F44L/S46D)和rRC-HL(F44L/S46E

5、)，同樣檢測拯救的突變病毒的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)突變病毒rRC-HL(F44L/S46D)和rRC-HL(F44LS46E)株的病毒轉(zhuǎn)錄能力和M蛋白表達(dá)量與親本株rRC-HL無異，而rRC-HL(F44L/S46A)株在病毒感染的早期，轉(zhuǎn)錄水平與rRC-HL(GX01M)株相近，后期病毒生長繁殖能力提高，接近親本株rRC-HL的水平，并沒有出現(xiàn)與rRC-HL(F44L/S46G)株一樣的顯著下調(diào)病毒轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，說明46位點(diǎn)的絲氨酸不是磷酸化

6、位點(diǎn)。
　　我們用拯救得到的所有毒株感染BSR/T7-9細(xì)胞，檢測RIG-Ⅰ信號通路蛋白，發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒M蛋白的表達(dá)量與TBK1表達(dá)水平之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著狂犬病病毒M蛋白量的增加TBK1的表達(dá)量下調(diào)，反之亦然，從而抵抗細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)。
　　用ELISA方法檢測感染狂犬病病毒的細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、 IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-12的情況。發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒感染BSR/T7-9細(xì)胞之后，TNF-α和IL-1