雞貧血病毒VP1基因的克隆、原核表達(dá)純化以及多克隆抗體的制備.pdf

1、雞貧血病毒(chicken anemia virus,CAV)是雞傳染性貧血病(Chicken infectiousanemia,CIA)的病原.CAV基因組共含有三個(gè)開放讀碼框,分別編碼VPl(51.6KD),VP2(24.0KD)和VP3(13.6KD)三種蛋白.其中VP1蛋白是CAV的唯一衣殼蛋白,而VP2是VP1的輔助蛋白,能幫助VP1形成正確的構(gòu)象,二者相互協(xié)調(diào)才能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用.VP3,也稱調(diào)亡素,能引起細(xì)胞凋亡,

2、與CAV的致病性有關(guān).∶本課題第一部分在獲得CAV全基因組的基礎(chǔ)上,首先根據(jù)Genbank中CAV哈爾濱分離株基因組序列,設(shè)計(jì)出針對(duì)CAV VP1全長(zhǎng)的引物和CAV VP1小片段(608bp)的引物,利用PCR方法從實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好并測(cè)序正確的pUC18-CAV質(zhì)粒中擴(kuò)增出VP1基因全長(zhǎng)和VP1小片段(608bp),各自雙酶切后將全長(zhǎng)和小片段基因按照正確的讀碼框克隆到原核表達(dá)載體pET 2ga(+)、pET41a(+)和pET32n(+

3、)上,得到含VP1基因全長(zhǎng)的pET28a(+)重組子和含VP1小片段的pET28a(+)、pET41a(+)和pET32a(+)重組子,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,并對(duì)經(jīng)抗生素初步篩選的重組子進(jìn)行雙酶切鑒定和序列鑒定.將雙酶切鑒定正確并且測(cè)序結(jié)果與Genbank上VP1基因序列完全一致的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3),28-37℃、1mMIPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá).經(jīng)SDS-PAGE和Western blottin

4、g檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)含VP1基因全長(zhǎng)和VP1小片段的pET28a(+)、pET41a(+)重組子誘導(dǎo)菌無(wú)明顯融合蛋白表達(dá),而含VP1基因小片段的pET32a(+)重組子誘導(dǎo)菌有分子量約42kDa的融合蛋白表達(dá),與預(yù)期分子量大小一致,并且表達(dá)蛋白大部分以包涵體形式存在. 利用目的蛋白的多聚組氨酸尾巴進(jìn)行鑷柱親和層析純化融合蛋白,經(jīng)Westernblotting鑒定,融合蛋白與His單抗能夠結(jié)合.純化出的蛋白經(jīng)PBS透析后濃縮,進(jìn)行SDS-

5、PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色后切膠.將切下含目的蛋白的膠用PBS溶解研成勻漿后液氮凍融三次,與佐劑乳化制備抗原免疫動(dòng)物,以收獲抗血清,并利用得到的抗血清進(jìn)行梯度稀釋作為一抗做蛋白質(zhì)印跡.利用經(jīng)1:200比例稀釋的抗血清作為一抗做的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果顯示,在PVDF膜上特異性的顯示出了分子量約為42KD的蛋白條帶. 綜上所述,重組質(zhì)粒pET32a(+)-VP1'(608bp)能夠成功地在大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中表達(dá)出目的蛋

6、白,而其它構(gòu)建的重組子未見明顯表達(dá).所獲得的重組質(zhì)粒.pET32a(+)-VP1'表達(dá)的融合蛋白與預(yù)期大小相同.利用親和層析純化后的蛋白制備抗原,免疫動(dòng)物獲得抗血清. 通過(guò)本課題第一部分的實(shí)驗(yàn),為后續(xù)制備單克隆抗體進(jìn)而更精確的檢測(cè)雞傳染性貧血病提供了良好的抗原來(lái)源,也為研究VPl與其他CAV蛋白之間的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ). 另外,本課題的第二部分著重研究了雞貧血病毒間的同源重組.CAV的遺傳變異性是極其有限的,同源重組是C

7、AV進(jìn)化的重要機(jī)制之一.因此研究清楚CAV間是否存在著同源重組、同源重組在CAV進(jìn)化上有什么作用,是非常重要的.我們從Genbank中挑選了來(lái)自世界各地分離出的CAV全基因組序列共31個(gè),對(duì)它們進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生的分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并使用SimPlot軟件推斷出疑似的重組序列,然后用bootscaning的方法來(lái)確定這些序列中是否真的存在同源重組.經(jīng)過(guò)上述研究我們首次發(fā)現(xiàn)了CAv的一個(gè)新的基因型,并且找到了序列AF999018可能的親本序