二甲基甲酰胺染毒致人肝細胞DNA損傷及維生素C干預作用研究.pdf

1、本實驗以體外培養(yǎng)人肝細胞為研究對象，采用噻唑藍(MTT)比色法觀察不同劑量DMF染毒不同時間對肝細胞增殖活性的影響，探討DMF致肝細胞損傷的劑量—效應關系和染毒時間—效應關系，及不同劑量VitC對DMF染毒肝細胞的干預作用。采用彗星試驗(單細胞凝膠電泳，SCGE法)，觀察不同劑量DMF染毒對肝細胞DNA的損傷，及不同劑量VitC對該損傷的干預作用，為預防DMF職業(yè)危害的發(fā)生，保護作業(yè)工人健康提供理論依據(jù)。 研究目的： 1

2、.探討不同劑量DMF染毒致正常成人肝細胞生長損傷及不同劑量VitC的干預作用。 2.探討不同劑量DMF對正常人肝細胞(HL-7702)DNA的損傷以及VitC對該損傷的干預作用。 研究方法： 1.將處于對數(shù)增長期的肝細胞制備成密度約5×105cell/ml細胞懸液，接種于9孔培養(yǎng)板中，每孔200μl細胞懸液；培養(yǎng)24h后分別以DMF染毒，DMF終濃度為1.56、6.25、25和100mmol/L同樣制備細胞懸液，

3、每孔加180μl細胞懸液和20μlVitC溶液，VitC終濃度為0.025、0.05和0.10mmol/L，培養(yǎng)24h后，以25、100mmol/LDMF進行染毒，繼續(xù)培養(yǎng)6h、12h、24h。采用噻唑蘭(MTT)比色法觀察DMF染毒致正常成人肝細胞毒性以及VitC干預后細胞生長變化率。以上均設陰性組和空白組。細胞生長變化率=(處理組吸光度-空白組吸光度)/(陰性組吸光度—空白組吸光度)。實驗中設定陰性組生長變化率為1.00，其余實驗組

4、與陰性組進行比較。 2.染毒結束后，用0.25％胰酶消化細胞，消化下的細胞再進行吹打，離心洗滌后懸浮于PBS液中。制成細胞密度大約為4×106個/ml的單細胞懸液，于4℃中保存。采用彗星實驗體外檢測1.56、6.25、25和100mmol/LDMF染毒6h、12h、24h后肝細胞DNA的損傷；以及0.025、0.05、0.10和0.25mmol/LVitC預處理后，100mmol/LDMF染毒6h、24h后肝細胞DNA的損傷。實

5、驗均設對照組和陰性組、陽性組，陽性組采用10umol/LH2O2染毒，所用的檢測指標為平均尾長(MTL)和平均尾相(MTM)。 研究結果： 1.MTT比色實驗： (1)DMF染毒實驗中，各染毒劑量細胞生長變化率結果均低于陰性組，差異有顯著意義，P＜0.01。各個染毒時間組內(nèi)，細胞生長變化率有隨染毒時間延長而下降的趨勢。有明顯的染毒時間—效應。以100mmol/LDMF劑量染毒24h細胞生長變化率0.56±0.09

6、為最低。 (2)VitC干預實驗中，①VitC干預+25mmol/LDMF染毒組內(nèi)，0.025和0.05mmol/LVitC劑量干預的DMF染毒組細胞生長變化率組高于非VitC干預的單純DMF染毒對照組，而0.10mmol/LVitC劑量干預的DMF染毒組細胞生長變化率組遠遠低于非VitC干預的單純DMF染毒對照組。②VitC干預的100mmol/LDMF染毒組內(nèi)，12h和24h組內(nèi)的0.025、0.05mmol/LVitC劑量

7、干預的DMF染毒組細胞生長變化率組均明顯高于非VitC干預的單純DMF染毒對照組，而0.10mmol/LVitC干預組細胞生長變化率組遠遠低于非VitC干預的單純DMF染毒對照組。 2.彗星實驗： (1)各染毒組MTL值與陰性組比較，差異有顯著意義，P＜0.05。各染毒組MTL值與陽性組比較，除6h組內(nèi)的6.25mmol/LDMF染毒劑量組外，其余時間組內(nèi)6.25、25和100mmol/LDMF染毒組MTL值差異未見顯著

8、意義，P＞0.05。隨著染毒劑量的增加，彗星MTL值隨之變大，有一定的劑量—效應關系；除100mmol/LDMF染毒組外，隨著染毒時間的增加，各染毒組彗星MTL值隨之變大，有明顯的染毒時間—效應關系。各染毒組平均尾相(MTM)值與陰性組比較，差異有顯著意義，P＜0.05。 (2)各VitC干預組與單純DMF染毒對照組MTL值比較，差異有顯著意義，P＜0.05；但0.10mmol/LVitC干預組與陽性組比較，MTL值差異未見顯著

9、意義，P＞0.05。VitC干預劑量為0.025、0.05和0.10mmol/L可以抑制DMF對肝細胞DNA損傷作用，而0.25mmol/LvitC干預劑量對DMF染毒肝細胞致DNA損傷沒有明顯的干預作用。 研究結論： 1.MTT實驗中： (1)DMF可抑制體外培養(yǎng)肝細胞的增殖。其中以100mmol/LDMF劑量組和24h染毒組細胞生長變化率為最低。各個染毒時間組內(nèi)，隨DMF劑量增高，細胞生長變化率有隨染毒時間延

10、長而下降的趨勢。 (2)0.025和0.05mmol/LVitC有降低DMF染毒引起細胞損傷的作用。而0.10mmol/LVitC在一定程度上有促進體外DMF染毒致肝細胞損傷的作用。 2.彗星實驗中： (1)不同劑量DMF處理肝細胞后，DNA均有不同程度的損傷；并且有隨著染毒劑量的加大，肝細胞DNA“彗星”的尾長值和尾相值逐漸增加的趨勢。 (2)0.025、0.05和0.10mmol/LVitC干預24h