創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：:
　　 創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是弧菌屬第五群細(xì)菌,革蘭染色陰性,彎曲、桿狀、多形性、運(yùn)動(dòng)活潑、有莢膜的細(xì)菌,主要生長于海水中的魚類及貝母類等體內(nèi),為嗜鹽性海生弧菌?？煞譃?種生物型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型),其中Ⅰ型是導(dǎo)致人類創(chuàng)傷感染和原發(fā)性敗血癥的主要致病菌,一般通過外傷接觸含病菌的海水或生食海鮮兩種途徑感染。因此創(chuàng)傷弧菌感染是海上創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中的重要問題,也是海產(chǎn)品食品衛(wèi)生中的重要問題。其感

2、染后可引起人體嚴(yán)重感染、膿毒敗血癥,其引發(fā)的多器官功能障礙綜合癥是膿毒敗血癥患者死亡的主要因?yàn)?病死率高達(dá)50％以上。創(chuàng)傷弧菌膿毒敗血癥的形成主要是大量的創(chuàng)傷弧菌侵入到血液之中,而血管內(nèi)皮細(xì)胞是阻擋創(chuàng)傷弧菌進(jìn)入血管的重要屏障。因此,創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制是創(chuàng)傷弧菌敗血癥形成機(jī)制中的重要問題。
　　 為揭示創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用,闡明創(chuàng)傷弧菌感染時(shí)對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響,我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究,為臨床創(chuàng)傷

3、弧菌感染的診治提供一定的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.創(chuàng)傷弧菌一般特性觀察和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響:
　　 1.1創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27562,購自中國科學(xué)院微生物研究所普通微生物保藏管理中心。復(fù)蘇培養(yǎng)后,行革蘭氏染色,光鏡觀察,劃線接種于硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂(thiosulfate-cifrae-bile salt-sucrose,TCBS)平板及普通營養(yǎng)瓊脂平板觀察其菌落形態(tài),并接種于

4、弧菌屬生化鑒定管及生化條培養(yǎng)24h后,機(jī)讀細(xì)菌鑒定結(jié)果。
　　 1.2人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell,HU),由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)科提供,對(duì)其進(jìn)行Ⅷ因子免疫熒光鑒定。我們通過本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6-7],對(duì)創(chuàng)傷弧菌對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的攻擊濃度進(jìn)行了界定,并通過96孔板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及MTT法對(duì)不同濃度的創(chuàng)傷弧菌侵襲過的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行增殖抑制率的測(cè)定；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

5、測(cè)量不同濃度的創(chuàng)傷弧菌對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞侵襲后即刻及24h細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度Vv對(duì)HU細(xì)胞凋亡的影響,選擇攻擊實(shí)驗(yàn)Vv的最高的實(shí)驗(yàn)終濃度103cfu/ml。通過Hoechest 33342熒光染色觀察HU細(xì)胞核的變化；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力的變化,以及50個(gè)高倍視野下正常細(xì)胞與侵襲后細(xì)胞核分裂數(shù)的變化,觀察極限殺傷濃度下細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。對(duì)正常組和創(chuàng)傷弧菌攻擊組(104cfu/m

6、l)的細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞面積(Ac)和周長(Cc)、細(xì)胞核的面積(An)、胞漿面積(Acp)、核漿比(Rnp)以及細(xì)胞與核的長軸(dmaxc,dmaxn),細(xì)胞與核的短軸(dminc,dminn),軸比(Rac、Ran),細(xì)胞與核的形狀因子PE(PEc、PEn),細(xì)胞與核的形狀因子AR(ARc、ARn),細(xì)胞與核的規(guī)劃形狀因子RFF(RFFc、RFFn),形狀不規(guī)則指數(shù)FⅡ(FⅡc、FⅡn)等參數(shù)的體視學(xué)測(cè)量以檢驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)傷弧

7、菌攻擊下增殖能力和細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 2、創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素的提取、鑒定以及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　 2.1取新鮮培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌,利用酚水法提取細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS),并對(duì)LPS進(jìn)行離心純化,以及根據(jù)2005版《中國藥典》規(guī)定用內(nèi)毒素測(cè)定方法“鱟試劑”對(duì)其進(jìn)行鑒定,并繪制濃度曲線,確定所提取的細(xì)菌LPS的濃度。
　　 2.2選擇創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度,選擇其上下濃度域共4個(gè)濃度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行M

8、TT,平板克隆,劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力的改變,以及流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率的測(cè)定。對(duì)正常組和內(nèi)毒素10000EU/ml攻擊組的細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞面積(Ac)和周長(Cc)、細(xì)胞核的面積(An)、周長(Cn)、細(xì)胞的體積(V),以及細(xì)胞的體積密度(Vv)、表面積密度(Sv)、數(shù)密度(Nv)等參數(shù)的體視學(xué)測(cè)量以檢驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)傷弧菌攻擊下增殖能力和細(xì)胞以及細(xì)胞核形態(tài)的改變,以判斷細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。
　　 3

9、、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素的鑒定和濃度的測(cè)定,以及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　 3.1本課題組前期已重組大腸桿菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21(DE3),行藍(lán)白斑篩選,挑選白色菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(rVVC),對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證,采用BCA(bicichoninicacid)法進(jìn)行蛋白定量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蛋白濃度。對(duì)SPF級(jí)BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔皮下多點(diǎn)注射,50mg/kg,小鼠

10、處死后對(duì)其立即解剖,取主要損傷臟器及組織固定、石蠟包埋后按常規(guī)方法制片、HE染色,光鏡下觀察病理變化。
　　 3.2選擇創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死濃度,選擇其濃度域上下共4個(gè)濃度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行MTT,平板克隆,劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力,并用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡率的測(cè)定。對(duì)正常組和溶細(xì)胞毒素3EU/ml攻擊組的細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞面積(Ac)和周長(Cc)、細(xì)胞核的面積(An)、周長(Cn)以及細(xì)胞的體積密度(Vv)、

11、表面積密度(Sv)、數(shù)密度(Nv)等參數(shù)的體視學(xué)測(cè)量以檢驗(yàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(rVVC)攻擊下增殖能力和細(xì)胞形態(tài)的改變,以判斷細(xì)菌溶細(xì)胞毒素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。
　　 結(jié)論:
　　 創(chuàng)傷弧菌對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的殺傷作用,其殺傷濃度閾值為103cfu/ml。創(chuàng)傷弧菌、創(chuàng)傷弧菌內(nèi)毒素(LPS)、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(VVC)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HU)的增殖有明顯的抑制作用