水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析.pdf

1、本研究通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物、RT-PCR擴(kuò)增并結(jié)合RACE方法克隆得到水稻脂氧合酶基因OsLOX1，原核表達(dá)并結(jié)合生化分析方法測(cè)定OsLOX1的酶學(xué)特性，對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、表達(dá)特性進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將正義和反義OsLOX1基因?qū)胨局仓辏接慜sLOX1在植物體內(nèi)的生理功能及其與抗蟲性的關(guān)系。 研究結(jié)果如下： 1、水稻種子成熟和萌發(fā)過程中脂氧合酶同工酶活力分析利用本實(shí)驗(yàn)室篩選到的LOX-3缺失突變體北

2、陸PL2和正常的水稻品種越光，研究種子成熟及萌發(fā)過程中LOX活性的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)2個(gè)水稻品種在種子成熟及萌發(fā)過程中LOX活性變化規(guī)律基本一致，即開花后的10-25天活性持續(xù)升高，以后趨于下降，但在LOX-3缺失的品種(北陸PL2)中變化很??；在萌發(fā)初期LOX活性迅速升高，浸水萌發(fā)后2天達(dá)到峰值，然后隨萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。同工酶分析顯示，在水稻成熟過程中種子LOX-3表達(dá)水平及活性都顯著高于其它兩種酶，而在種子萌發(fā)過程中LOX-2表達(dá)水

3、平和活性占優(yōu)勢(shì)，LOX-1則在兩種情況下都顯示較低的表達(dá)水平和活性。研究也進(jìn)一步證明北陸PL2是LOX-3缺失的水稻品種。 2、水稻成熟過程種胚RNA提取方法的建立建立了一種全新、簡(jiǎn)單的提取水稻種胚RNA的CTAB-LiCl提取法，可在不用液氮的室溫下有效地排種胚中大量帶有的多糖和本身脂質(zhì)的干擾，所得RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳分析證明具有較高的純度和完整性，并可進(jìn)一步滿足RT-PCR、Northern印跡以及cD

4、NA文庫構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)需要，適用于富含多糖和脂質(zhì)的植物組織RNA的提取。 3、水稻種子脂氧合酶基因OsLOX1的克隆、序列分析與表達(dá)規(guī)律研究根據(jù)脂氧合酶的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR方法，從水稻種胚中克隆了一個(gè)新的脂氧合酶基因cDNA片段。進(jìn)一步用5′-RACE和3′-RACE的方法得到該基因3154bp的全長(zhǎng)cDNA(OsLOX1，GenBank登錄號(hào)：DQ389164)。進(jìn)一步克隆了OsLOX1的基因組DNA，OsLO

5、X1基因具有9個(gè)外元，8個(gè)內(nèi)元。Southern分析顯示該基因在基因組中是單拷貝克隆。分析了該基因啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有種子特異表達(dá)的順式元件和多個(gè)受傷害以及茉莉酸誘導(dǎo)的順式作用元件。組織表達(dá)譜分析表明，OsLOX1在未成熟胚、萌發(fā)過程中的種子及幼苗都以較低的水平表達(dá)，在正常的根、莖和葉中都不表達(dá)，而三葉期的幼苗經(jīng)過傷害誘導(dǎo)3小時(shí)后OsLOX1表達(dá)量最高，且褐飛虱取食后其轉(zhuǎn)錄物表達(dá)量也急劇升高，至6小時(shí)達(dá)到最高值。這些結(jié)果都表明，

6、OsLOX1的表達(dá)受生物和非生物逆境脅迫誘導(dǎo)，參與水稻的防御反應(yīng)；另外，該酶還參與水稻的生長(zhǎng)發(fā)育過程。 4、水稻種子脂氧合酶OsLOX1在大腸桿菌中的表達(dá)與蛋白特性研究以本實(shí)驗(yàn)室克隆到的水稻種子脂氧合酶OsLOX1全長(zhǎng)cDNA為模板，用含有特異酶切位點(diǎn)的P1、P2為引物，通過PCR方法得到該基因的編碼框全長(zhǎng)。將其構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體pET30a(+)上，轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)菌株，獲得含OsLOX1的重組工程菌。經(jīng)過IPT

7、G誘導(dǎo)，水稻脂氧合酶基因OsLOX1的表達(dá)產(chǎn)物在表達(dá)菌株中大量積累。誘導(dǎo)16小時(shí)后用超聲波破碎儀裂解表達(dá)菌株，裂解液用組氨酸標(biāo)簽試劑盒進(jìn)行純化和復(fù)性。復(fù)性后的蛋白以亞油酸為底物進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果顯示，該蛋白具有明顯的脂氧合酶催化活性。利用比色法測(cè)得該酶的最適溫度為30℃及最適PH值4.8。本實(shí)驗(yàn)以原核表達(dá)的方法得到、并使用組氨酸標(biāo)記試劑盒純化出具有生理活性的水稻種子脂氧合酶OsLOX1，為植物種子脂氧合酶的研究提供了一種可靠的供選擇方法

8、，也為更好地研究水稻種子脂氧合酶OsLOX1的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了良好的材料和方法。研究的結(jié)果也進(jìn)一步表明本試驗(yàn)所克隆的基因OsLOX1編碼的蛋白可能是水稻脂氧合酶-1(LOX-1)。 5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)正義和反義OsLOX1基因水稻植株及其抗蟲性鑒定利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有水稻脂氧合酶基因OsLOX1的兩個(gè)雙元載體pLOX1S(35SPro.5’+OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，pLOX1A(35SPro.

9、5’+antisene-OsLOX1cDNA+NosTer3’)，轉(zhuǎn)入粳稻栽培品種北陸PL2中，共得到46個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過潮霉素篩選葉片和PCR驗(yàn)證確定得到32個(gè)陽性的轉(zhuǎn)基因水稻植株，陽性率為69.6％。潮霉素篩選葉片、種子和Southern blot等檢測(cè)都表明，目的基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。RT-PCR、酶活測(cè)定的結(jié)果都表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因水稻中有不同程度的表達(dá)。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行褐飛虱的鑒定發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株相