體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化的初步研究.pdf

1、目的： 近年來(lái)，肝硬化的發(fā)病率和病死率逐年升高，已成為繼心腦血管和腫瘤之后的又一嚴(yán)重威脅人類生命的重大疾病。在我國(guó)病發(fā)的肝硬化中，以病毒性肝炎所致的肝硬化最為常見(jiàn)。迄今為止，對(duì)于本病的治療尚無(wú)良策，主要是采用對(duì)癥療法，療效不佳。肝臟移植是目前治療各種終末期肝病的有效方法，但由于供體來(lái)源受限，因而限制了臨床肝移植研究的進(jìn)展。近期國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，

2、BM-MSCs)具有多向分化潛能，在一定條件下經(jīng)體內(nèi)、體外誘導(dǎo)可定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，有望成為治療終末期肝病的一種新型種子細(xì)胞。但是不同的分化條件(基礎(chǔ)培養(yǎng)、細(xì)胞密度、機(jī)械力、生長(zhǎng)因子等)對(duì)BM-MSCs分化產(chǎn)生很大影響，BM-MSCs在體外被誘導(dǎo)成肝細(xì)胞所需的最佳誘導(dǎo)因子以及其用量還值得進(jìn)一步的研究。 本實(shí)驗(yàn)以此為目的，在體外分離培養(yǎng)BM-MSCs的基礎(chǔ)上，采用不同劑量的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hep

3、atocyte growth factor，HGF)和成纖維生長(zhǎng)因子-2(Fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)分別或聯(lián)合誘導(dǎo)，觀察不同的生長(zhǎng)因子及其用量與誘導(dǎo)分化效果的關(guān)系，為BM-MSCs臨床治療肝硬化的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、BM-MSCs的原代及傳代培養(yǎng)選取四周齡、90-100g、雄性、健康的SD大鼠，獲取BM-MSCs，在37℃、5％CO2條件下，用含10％胎牛血清的L

4、-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每隔三天換液一次。當(dāng)細(xì)胞鋪滿全層時(shí)，以1:2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，三代后獲取較為純化的BM-MSCs。 二、體外定向誘導(dǎo)BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化取第3代的BM-MSCs，分為六組分別誘導(dǎo)。調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105分別接種于放有消毒蓋玻片的24孔板內(nèi)，用含不同生長(zhǎng)因子和10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)，分組情況如下表： 每隔三天換液一次，定期收集培養(yǎng)液及細(xì)胞爬片。 三、鑒定

5、 (一)細(xì)胞形態(tài)學(xué)加入各種誘導(dǎo)成分后，每天用倒置顯微鏡觀察每組并記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。 (二)檢測(cè)肝細(xì)胞特征性標(biāo)志物1、細(xì)胞糖原染色將誘導(dǎo)后12天、24天留取的細(xì)胞爬片進(jìn)行糖原染色。 2、ELISA將誘導(dǎo)后3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、24天留取的細(xì)胞上清夜進(jìn)行ELISA檢測(cè)細(xì)胞AFP的分泌。 3、免疫細(xì)胞化學(xué)將誘導(dǎo)后12天、24天留取的細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞ALB和CK19的

6、分泌。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、成功培養(yǎng)出了BM-MSCs，光學(xué)顯微鏡下呈纖維樣細(xì)胞形態(tài)，均一性較高，細(xì)胞呈平行排列或漩渦狀生長(zhǎng)，十天左右可鋪滿全層。經(jīng)過(guò)3次傳代獲得較為純化的BM-MSCs，背景雜細(xì)胞明顯減少。 2、第一組到第五組經(jīng)誘導(dǎo)后，形態(tài)學(xué)有了明顯的改變，細(xì)胞形態(tài)從棱形，多角形，逐漸向紡錘、不規(guī)則圓形或多角形增多，10天左右出現(xiàn)卵圓形改變，與肝細(xì)胞形態(tài)相似。第六組細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化。 3、第一組到第五組

7、經(jīng)誘導(dǎo)后，特別是第一、第二和第四組，行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)ALB、CK19以及糖原染色檢測(cè)糖原分泌12天均有陽(yáng)性結(jié)果，24天陽(yáng)性率明顯增高；ELISA檢測(cè)AFP，第3天即有分泌，第12天表達(dá)最高，以后逐漸減少。第六組無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。 結(jié)論： 1、FGF-2(20ng/ml)、FGF-2(10ng/ml)、HGF(20ng/ml)、HGF(20ng/ml)+FGF-2(10ng/ml)分別能有效地誘導(dǎo)BM-MSCs定向向肝細(xì)胞樣細(xì)

8、胞方向分化。 2、FGF-2(20ng/ml)比HGF(20ng/ml)具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力。 3、FGF-2濃度在10ng/ml以上時(shí)，對(duì)BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，F(xiàn)GF-2濃度在10ng/ml以下時(shí)，體外誘導(dǎo)BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化的作用劇減。 4、FGF-2在體外誘導(dǎo)BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化時(shí)，對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變影響很大，作