蚊核糖體蛋白L39基因克隆及初步功能的研究.pdf

1、媒介昆蟲嚴(yán)重危害人類健康，據(jù)估計(jì)傳染病中2/3由媒介昆蟲傳播。世界史上許多危害嚴(yán)重的蟲媒傳染病如鼠疫、斑疹傷寒、黃熱病、瘧疾等都曾造成廣泛的流行并奪去成千上萬(wàn)人的生命。當(dāng)今世界隨著人類交往的日益頻繁，發(fā)現(xiàn)許多新的和重新出現(xiàn)的蟲媒傳染病?；瘜W(xué)防治一直是媒介綜合治理的主要方法。殺蟲劑的大量、連續(xù)使用導(dǎo)致了媒介抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前，世界范圍內(nèi)至少已有504種昆蟲產(chǎn)生了抗藥性，包括主要的媒介昆蟲，其中109種(亞種)蚊對(duì)一種或多種殺蟲劑產(chǎn)生

2、了抗性。殺蟲劑抗性直接影響著蟲媒傳染病的流行和重新流行，因此，研究媒介抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制并進(jìn)行適宜治理實(shí)乃當(dāng)務(wù)之急。本研究擬從克隆抗藥性相關(guān)基因入手，并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定，繼而研究其下游蛋白質(zhì)組學(xué)，為探討最終治理媒介抗藥性奠定基礎(chǔ)。為此，本文進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究。 一、淡色庫(kù)蚊核糖體蛋白L39基因的分子克隆、序列分析及表達(dá)差異鑒定 為克隆淡色庫(kù)蚊核糖體蛋白L39基因并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)差異的鑒定，本研究采用RT-PCR技術(shù)和c

3、DNA末端快速擴(kuò)增(RACE)策略，從淡色庫(kù)蚊(Culex pipiens pallens)對(duì)溴氰菊酯抗性品系4齡幼蟲中克隆核糖體蛋白L39基因(RPL39)，用相應(yīng)的軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并用熒光定量PCR和半定量RT-PCR分析敏感、抗性品系蚊的RPL39表達(dá)水平及對(duì)蚊各期RPL39進(jìn)行表達(dá)差異鑒定。結(jié)果表明，成功克隆出RPL39基因。RPL39基因全長(zhǎng)508bp，開放閱讀框?yàn)?56bp，編碼51個(gè)氨基酸(GenBank/NCBI

4、 DQ080075)。序列分析顯示，該基因在各物種中保守性很高，與已報(bào)告的岡比亞按蚊(Ahophelesgambiae)核糖體蛋白L39基因(GenBank/NCBI XP 320713)有99％同源性，并具有一個(gè)經(jīng)典的核糖體蛋白L39結(jié)構(gòu)域，沒有跨膜區(qū)域，無(wú)信號(hào)肽序列，屬于胞漿蛋白。熒光定量PCR結(jié)果表明，RPL39在淡色庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯抗性品系中表達(dá)水平高于敏感品系，提示RPL39基因可能與對(duì)殺蟲劑的抗藥性相關(guān)。RPL39 mRNA在

5、淡色庫(kù)蚊抗性/敏感品系各個(gè)發(fā)育階段也有不同的表達(dá)，以雌性成蚊表達(dá)差異最大。 二、淡色庫(kù)蚊核糖體蛋白L39基因的初步功能研究 為鑒定核糖體蛋白L39基因與淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性的關(guān)系，本研究擴(kuò)增RPL39基因編碼區(qū)，構(gòu)建蚊細(xì)胞表達(dá)載體pIB/V5-His/RPL39，轉(zhuǎn)染蚊C6/36細(xì)胞。稻瘟菌素穩(wěn)定篩選和單克隆化后，細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用RT-PCR和Western blot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。不同濃度的溴氰菊酯處

6、理穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及對(duì)照未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)無(wú)關(guān)基因細(xì)胞后，用<'3>H-TdR測(cè)定細(xì)胞生存率法、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定及顯微鏡下觀察細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖速度及細(xì)胞生長(zhǎng)情況等。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，RT-PCR和Western blot檢測(cè)重組表達(dá)載體(pIB/V5-His/RPL39)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的蚊細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。不同濃度的溴氰菊酯處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在藥物壓力下，轉(zhuǎn)染核糖體蛋白L39目的基因細(xì)胞組的EC50顯著高于轉(zhuǎn)

7、染無(wú)關(guān)基因CAT細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染空細(xì)胞組(p<0.05)。細(xì)胞的增值速度也快于對(duì)照細(xì)胞；轉(zhuǎn)染RPL39基因細(xì)胞的形態(tài)、密度未見明顯變化，而對(duì)照細(xì)胞顆粒變粗、密度降低。初步研究結(jié)果提示，RPL39基因與溴氰菊酯抗性相關(guān)，可能為溴氰菊酯抗性相關(guān)基因。 三、淡色庫(kù)蚊核糖體蛋白L39下游蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究 為探討核糖體蛋白L39 的抗藥性作用機(jī)制及與其他蛋白質(zhì)的相互作用，采用對(duì)轉(zhuǎn)染核糖體蛋白L39基因細(xì)胞進(jìn)行二維電泳和質(zhì)譜鑒定的方

8、法，對(duì)表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染核糖體蛋白L39基因的細(xì)胞高表達(dá)一系列與其他物種的各種酶高度同源的蛋白，例如酚氧化酶前體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白磷酸酶、精氨酸琥珀酸鹽移解酶、酪氨酸磷酯酶、以及具有降解多種藥物功能的多藥耐藥蛋白等；轉(zhuǎn)染細(xì)胞還高表達(dá)一系列和其他物種轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白高度同源的蛋白，例如 ATP結(jié)合轉(zhuǎn)錄亞家族B、跨膜GTP酶、DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子、轉(zhuǎn)錄子的穩(wěn)定期調(diào)節(jié)蛋白、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)