FOXA1在雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌化療耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且近十年來(lái)，其發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性健康。乳腺癌作為高度異質(zhì)性的腫瘤，根據(jù)雌激素受體(Estrogen Receptor, ER)表達(dá)可分為ER陽(yáng)性及ER陰性，根據(jù)基因分析又可分為luminal A型、luminalB型、基底細(xì)胞樣型、HER-2過(guò)表達(dá)型及Normal-like等不同分子分型。盡管乳腺癌治療手段較為多樣，化療的重要地位仍不可撼動(dòng)，尤其近年來(lái)術(shù)前新輔助化療的廣泛開(kāi)

2、展使部分T2、T3期患者達(dá)到降期及保乳的目的，進(jìn)而提高了患者的腫塊切除率及生活質(zhì)量。盡管尚不明確具體機(jī)制，目前陸續(xù)有研究顯示ER陽(yáng)性乳腺癌患者中雖有一部分對(duì)化療敏感，但總體而言化療反應(yīng)較差，因此循證醫(yī)學(xué)依據(jù)對(duì)在該類患者中使用新輔助化療推薦力度較弱，轉(zhuǎn)而較為推薦對(duì)ER陽(yáng)性患者有一定療效的新輔助內(nèi)分泌治療。然而盡管ER陽(yáng)性乳腺癌患者輔助內(nèi)分泌治療療效較好且總體預(yù)后佳，仍有部分患者在術(shù)前術(shù)后的內(nèi)分泌治療中出現(xiàn)耐藥甚至復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，考慮到該類內(nèi)分泌

3、治療無(wú)效患者中可能存在化療敏感者，目前已有循證依據(jù)及診療常規(guī)均建議此時(shí)給予化療，而由于迄今為止尚無(wú)分子標(biāo)記物或臨床病理指標(biāo)可有效預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者化療療效，因此在這部分患者的術(shù)后輔助及復(fù)發(fā)后化療方案選擇方面存在一定的盲目性。鑒于ER陽(yáng)性表達(dá)者占所有乳腺癌的75％-80％，故該類患者總數(shù)可能較為可觀，因此若能找到有效的分子標(biāo)記物對(duì)ER陽(yáng)性患者進(jìn)行化療療效預(yù)測(cè)以及預(yù)后判斷，將有助于篩選該類患者以使其接受有效治療并進(jìn)一步預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)歸。FOX

4、A1又稱HNF3α（肝細(xì)胞核因子3α），為FOX翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，經(jīng)研究證實(shí)在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞表達(dá)較正常組織為高且能作為ER的先鋒因子，影響其與DNA結(jié)合。本文擬探索FOXA1是否可能成為與ER陽(yáng)性乳腺癌化療療效相關(guān)的有效分子標(biāo)記物。鑒于新輔助化療作為有效的體內(nèi)藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可用以篩選化療敏感者及其適合的化療方案，故本研究首先以ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療患者為研究對(duì)象，探索FOXA1與化療療效的相關(guān)性，若兩者確實(shí)相關(guān)，擬通過(guò)

5、體外研究初步探索該相關(guān)性的可能機(jī)制;最后通過(guò)臨床回顧性分析探索FOXA1與ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療患者預(yù)后的相關(guān)性以明確FOXA1在此類患者中是否同時(shí)具有預(yù)后判斷價(jià)值。
　　方法和結(jié)果:
　　1.FOXA1表達(dá)與ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療后病理反應(yīng)的相關(guān)性分析
　　2002年至2012年我科收治的123例ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療患者，行化療前腫塊穿刺標(biāo)本FOXA1免疫組化染色及Histoscore評(píng)分，對(duì)術(shù)后大體標(biāo)本HE

6、染色切片進(jìn)行閱片，根據(jù)Miller& Payne病理學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)判斷新輔助化療病理反應(yīng)并分為兩組:病理無(wú)反應(yīng)（G1-3，大于10％腫瘤細(xì)胞殘留）及病理有反應(yīng)(G4-5，0-10％腫瘤細(xì)胞殘留)。結(jié)果顯示病理有反應(yīng)率25.2％（31例），病理無(wú)反應(yīng)率74.8％(92例)?？ǚ綑z驗(yàn)顯示ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療患者化療前穿刺標(biāo)本FOXA1表達(dá)水平與化療后病理反應(yīng)（0～10％腫瘤細(xì)胞殘留vs.大于10％腫瘤細(xì)胞殘留）相關(guān)(P=0.002)，F(xiàn)OX

7、A1表達(dá)較高者病理反應(yīng)率較低，腫瘤細(xì)胞殘留較多。為明確該相關(guān)性是否與ER表達(dá)有關(guān)，將ER進(jìn)行不同分組（評(píng)分1，2，3三組;評(píng)分1，2與3兩組;評(píng)分1與2，3兩組）并與上述FOXA1表達(dá)分別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均不存在相關(guān)性（p值分別為0.702，0.345及0.564）。結(jié)果提示，F(xiàn)OXA1可能可以獨(dú)立于ER作為ER陽(yáng)性乳腺癌患者的化療療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，并具有體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究的價(jià)值。
　　2.FOXA1在ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中的耐藥特性

8、及其機(jī)制研究
　　該部分?jǐn)M在體外實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)一步驗(yàn)證FOXA1表達(dá)與ER陽(yáng)性乳腺癌化療敏感性相關(guān)，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡、增殖、克隆形成、遷移及侵襲等生物學(xué)行為及耐藥相關(guān)分子變化以探索該相關(guān)性的可能機(jī)制。
　　首先MTT法檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D及MCF-7經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)形成的耐藥株MCF-7/ADR(以下簡(jiǎn)稱M/A)對(duì)臨床乳腺癌化療最常用蒽環(huán)類代表藥阿霉素及紫杉類代表藥紫杉醇的敏感性差異，Wes

9、tern blot檢測(cè)三者FOXA1蛋白表達(dá)差異，結(jié)果顯示化療敏感性由高至低為MCF-7、T47D及M/A，而FOXA1表達(dá)水平由低至高亦為MCF-7、 T47D及M/A。初步提示FOXA1表達(dá)水平與ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株化療敏感性相關(guān)。
　　繼而使用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)FOXA1質(zhì)粒(pMD2G、pSPAX2、pSI-FOXA1)以及對(duì)照空載質(zhì)粒(pMD2G、pSPAX2、pSI-NEG)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FOXA1弱表達(dá)的MCF-7細(xì)胞株，嘌呤

10、霉素篩選，Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功。選取MCF-7/FOXA1-15（以下簡(jiǎn)稱MF15）及MCF-7/FOXA1-20(以下簡(jiǎn)稱MF20)兩株FOXA1過(guò)表達(dá)克隆株、以MCF-7/veetor空載對(duì)照（以下簡(jiǎn)稱Mneg）連同MCF-7母代細(xì)胞作為陰性對(duì)照、以FOXA1較高表達(dá)的T47D及M/A作為陽(yáng)性對(duì)照，用MTT法檢測(cè)對(duì)阿霉素及紫杉醇化療敏感性變化;流式技術(shù)比較細(xì)胞周期、凋亡;MTT檢測(cè)生長(zhǎng)曲線;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形

11、成能力;Transwell小室測(cè)遷移/侵襲能力等功能實(shí)驗(yàn)探索FOXA1過(guò)表達(dá)對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示FOXA1過(guò)表達(dá)的MF15、MF20及較高表達(dá)的T47D、M/A細(xì)胞株對(duì)阿霉素及紫杉醇的化療敏感性均明顯較FOXA1低表達(dá)的MCF-7及Mneg差，F(xiàn)OXA1過(guò)表達(dá)或高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期從G1進(jìn)入到S/G2期、凋亡抑制、增殖加快、克隆形成及遷移侵襲能力增加。
　　隨后通過(guò)siRNA干擾技術(shù)敲低ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)

12、胞株MCF-7、M/A及T47D的FOXA1表達(dá)，RT-qPCR及Western blot驗(yàn)證敲低成功。同上述過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行化療敏感性及生物學(xué)行為檢測(cè)。結(jié)果顯示FOXA1表達(dá)敲低后MCF-7、M/A及T47D化療敏感性均出現(xiàn)不同程度增加，并可使細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯、凋亡增加、增殖減緩、克隆形成及遷移侵襲能力減弱。
　　基于以上改變使用RT-qPCR及Western blot技術(shù)，檢測(cè)上述FOXA1過(guò)表達(dá)及敲低實(shí)驗(yàn)中耐藥相關(guān)基因及

13、蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示在mRNA及蛋白水平，F(xiàn)OXA1過(guò)表達(dá)或高表達(dá)時(shí)耐藥相關(guān)基因GST-pi顯著增加;細(xì)胞周期相關(guān)基因cyclinE1增加，cyclinD1、p53、p27、p21表達(dá)下降;抗凋亡基因Bcl-xl明顯增加;FOXA1敲低后上述基因出現(xiàn)相反變化。此外，F(xiàn)OXA1表達(dá)變化還可影響TGF-β信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白TGF-β、經(jīng)典信號(hào)通路中AKT及MAPK(p38)磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　3.ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療前后FO

14、XA1表達(dá)差異及預(yù)后相關(guān)性分析
　　因前兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXA1表達(dá)可引起ER陽(yáng)性乳腺癌化療敏感性及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力改變，故該部分?jǐn)M探索此類患者中FOXA1在化療后殘留腫瘤組織中的表達(dá)情況及其是否具有預(yù)后判斷價(jià)值。
　　首先選取實(shí)驗(yàn)第一部分123例患者中具有新輔助化療后手術(shù)大體標(biāo)本的110例進(jìn)行術(shù)后標(biāo)本FOXA1免疫組化染色及Histoscore評(píng)分，Wilcoxon帶符號(hào)秩分析顯示上述患者新輔助化療前后FOX

15、A1陽(yáng)性率及表達(dá)量均無(wú)明顯改變（p值分別為0.078及0.129），但FOXA1染色定位改變顯著(p＜0.0001)，表現(xiàn)為胞核胞漿共染者由化療前2.7％增至化療后31.8％。進(jìn)一步卡方檢驗(yàn)及Kaplan-Meier生存分析分別顯示化療后FOXA1染色定位與ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療患者化療療效及預(yù)后均無(wú)相關(guān)性（p值分別為0.208及0.828）。
　　隨后對(duì)第一部分中123例資料完整的ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療患者先后行卡方檢驗(yàn)及K

16、aplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)以Histoscore大于3作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，F(xiàn)OXA1表達(dá)不與包括年齡、月經(jīng)、組織學(xué)分類、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯、癌結(jié)節(jié)形成、病理分期T、N、M，免疫組化染色ER、PR、HER-2、Ki67、E-cadherin、P53以及l(fā)uminal分型在內(nèi)的任何臨床病理指標(biāo)相關(guān)，也不與ER陽(yáng)性、luminalA及l(fā)uminalB型新輔助化療患者預(yù)后相關(guān)。
　　通過(guò)嘗試，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)以FOXA1評(píng)分大于等于

17、20及小于20進(jìn)行分組時(shí)，可較好區(qū)分ER陽(yáng)性及l(fā)uminalA型而非luminalB型患者的預(yù)后（p分別為0.026，0.012及0.691）?？ǚ綑z驗(yàn)顯示FOXA1評(píng)分大于等于20與年齡大于50歲及絕經(jīng)后狀態(tài)相關(guān)（p值分別為0.012及0.005），但不與ER陽(yáng)性乳腺癌新輔助化療療效相關(guān)(p=0.110)。COX回歸模型單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)FOXA1評(píng)分大于等于20可做為ER陽(yáng)性（單因素p=0.026，多因素p=0.004）及l(fā)um

18、inalA型（單因素p=0.012，多因素p=0.003）乳腺癌新輔助化療患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)臨床回顧性分析提示FOXA1與ER陽(yáng)性乳腺癌患者化療療效相關(guān)，可能可以作為該類患者的化療療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。體外實(shí)驗(yàn)顯示FOXA1表達(dá)可能通過(guò)影響TGF-β、AKT、MAPK(p38)等信號(hào)通路，p53、p27、p21、cyclinE1、Bcl-xl、GST-pi等分子，及其下游細(xì)胞周期、凋亡、增殖等生物學(xué)