納米相羥基磷灰石對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長及成骨分化的影響.pdf

1、因創(chuàng)傷感染腫瘤等原因引起的骨缺損目前仍無較好的治療方法。傳統(tǒng)方法主要以自體骨片移植為主,這種治療方式常易導(dǎo)致供體部位的損傷及功能缺陷。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,體外構(gòu)建的人工骨有望在不帶來嚴(yán)重并發(fā)癥的前提下徹底重建缺損的骨組織。 人工構(gòu)建的骨組織通常由種子細(xì)胞和支架材料構(gòu)成。羥基磷灰石(HAP)是構(gòu)成人體硬組織,如牙齒、骨骼的無機(jī)成分。人工合成的羥基磷灰石由于與天然硬組織的化學(xué)成分相似,因而具有良好的生物相容性,已被許多研究用做構(gòu)建

2、組織工程骨的支架材料。然而以前人工合成的HAP(cHAP)在顆粒大小與形態(tài)方面與天然羥基磷灰石迥然不同。天然骨組織中的羥基磷灰石以數(shù)十納米的晶體形式存在,而正是這些數(shù)十納米晶體的有序排列構(gòu)成了骨組織的力學(xué)屬性[10]。以納米相羥基磷灰石(nHAP)為支架材料的組織工程骨有望獲得更好的超微結(jié)構(gòu)上的生物模擬性和更優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類從骨髓中分離的具有強(qiáng)大增殖能力和多向分化能力的干細(xì)胞,在一定條件下可

3、分化為骨、軟骨、脂肪、肝、神經(jīng)、心肌等多種組織細(xì)胞。較胚胎干細(xì)胞具有無致瘤性、無倫理學(xué)爭議、免疫原性弱等優(yōu)點(diǎn)。較成骨細(xì)胞具有可獲得性良好及擴(kuò)增能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛認(rèn)為是骨組織工程種子細(xì)胞的理想來源。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和納米相羥基磷灰石復(fù)合構(gòu)建的人工骨有望成為未來骨組織工程研究和應(yīng)用的主流。 組織工程學(xué)的重要研究內(nèi)容之一是支架材料對種子細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。目前nHAP對MSCs生長及分化的影響尚未得到充分闡明。本研究旨在詳細(xì)

4、闡述作為支架材料的nHAP對于種子細(xì)胞MSCs生長及成骨分化等生物學(xué)行為的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,nHAP顆粒對MSCs的生長、分化、礦化等生物學(xué)行為具有廣泛的影響。nHAP顆粒對MSCs的生長的作用依劑量不同而有很大區(qū)別。nHgP劑量低于2μg/104 cells可顯著促進(jìn)細(xì)胞生長,然而在無血清培養(yǎng)條件下這種促增殖作用消失。說明這種促進(jìn)作用與nHAP的蛋白吸附功能有關(guān)。吸附血清蛋白的nHAP粘附于細(xì)胞表面,使細(xì)胞周圍產(chǎn)生局部性血

5、清蛋白濃度升高,從而有利于細(xì)胞生長。此外當(dāng)采用插入式培養(yǎng)皿對細(xì)胞及顆粒進(jìn)行分離式共培養(yǎng)時(shí),這種促增殖作用也消失。說明顆粒與細(xì)胞的接觸對這種促增殖作用是必需的。也從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)nHAP的蛋白吸附功能與其促細(xì)胞增殖作用有密切關(guān)系。當(dāng)nHAP劑量高于20μg/104cells可顯著抑制細(xì)胞增殖。在無血清及分離式共培養(yǎng)條件下,這種抑制增殖作用同樣存在。說明這種抑制作用是通過顆粒改變培養(yǎng)液條件而產(chǎn)生的。對于細(xì)胞分化,nHAP顆?？娠@著促進(jìn)MSC

6、s的成骨分化但卻顯著抑制細(xì)胞礦化,分離式共培養(yǎng)條件下產(chǎn)生同樣結(jié)果。說明這些作用同樣是通過顆粒改變培養(yǎng)液條件而產(chǎn)生的。nHAP對培養(yǎng)液條件的改變最有可能是改變其中的鈣磷濃度。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)nHAP可使培養(yǎng)液中的鈣磷濃度降低而不是升高。推測可能是nHAP顆粒在培養(yǎng)液中出現(xiàn)晶體生長而吸收鈣磷離子,從而降低Ca、P濃度。將MSCs種植于nHAP基質(zhì)表面,細(xì)胞同樣可貼壁、增殖與成骨分化。但其貼壁增殖與分化的特征與在普通培養(yǎng)基質(zhì)(孔板)上顯著不同。細(xì)胞

7、貼壁的速度與在孔板上相似,均于2h已出現(xiàn)貼壁,約16小時(shí)完成貼壁。但貼壁數(shù)量顯著少于孔板。約60％接種細(xì)胞可最終完成貼壁,而在普通孔板上約85％細(xì)胞可以完成貼壁。在增殖速度方面,nHAP上的細(xì)胞也比在孔板上的細(xì)胞慢,它們的倍增時(shí)間分別是110h Vs 60h。然而值得注意的是,盡管增殖速度較慢,nHAP上的細(xì)胞同樣可以長滿底面。因而MSCs在nHAP表面的增殖是可以滿足需要的。此外在nHAP上MSCs的成骨分化顯著增強(qiáng)。nHAP條件培養(yǎng)

8、液同樣可使MSCs成骨分化增強(qiáng),說明是nHAP改變培養(yǎng)液條件從而促進(jìn)MSCs成骨分化。此結(jié)果與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。 nHAP基質(zhì)與普通羥基磷灰石基質(zhì)(cHAP)在表面微地形、親水性、蛋白吸附、離子交換等特征方面有許多不同。與cHAP相比,nHAP基質(zhì)更有利于細(xì)胞貼壁和增殖。但細(xì)胞在兩種基質(zhì)上的成骨分化卻大致相當(dāng)。但由于貼壁和增殖效率高,在接種等量細(xì)胞后,nHAP基質(zhì)上的細(xì)胞表達(dá)總蛋白、堿性磷酸酶、骨鈣素等的總量仍高于cHAP表面的

9、細(xì)胞。 nHAP可改變培養(yǎng)液中的鈣磷濃度。這種改變可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長分化等生物學(xué)行為的改變。為此我們觀察了不同鈣磷濃度及其組合對MSCs增殖與成骨分化的影響。結(jié)果顯示,鈣磷濃度降低可抑制細(xì)胞增殖與分化,而不是促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化。當(dāng)鈣濃度升高時(shí),對細(xì)胞增殖沒有影響,但可促進(jìn)細(xì)胞礦化抑制細(xì)胞分化。當(dāng)磷濃度升高時(shí),可抑制細(xì)胞生長但對成骨分化沒有顯著影響。這部分實(shí)驗(yàn)表明,nHAP降低培養(yǎng)液中鈣磷濃度,可能是其抑制細(xì)胞生長與礦化的機(jī)理,但