過表達肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a抑制缺氧誘導心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡的研究.pdf

1、缺血性心臟病是目前心力衰竭發(fā)生的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。隨著細胞生物學和分子生物學的飛速進展，人們對缺血性心臟病發(fā)生、發(fā)展機制有了進一步認識，其防治措施也取得了較大進展。基因治療作為一種新的治療策略為缺血性心臟病的治療提供了新的途徑。近年來有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的信號轉(zhuǎn)導通路與效應的研究非?；钴S。研究發(fā)現(xiàn)，ERS介導的細胞凋亡在心肌缺血、心力衰竭進展過程

2、中起重要作用。有研究表明，主動脈縮窄引起的心臟壓力過負荷可以誘導ERS，導致心肌細胞凋亡增多，而轉(zhuǎn)基因高表達GRP78、GRP94等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶可減輕甚至取消內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、促進細胞存活。
　　 鈣穩(wěn)態(tài)失衡是誘導ERS發(fā)生的重要原因。在參與Ca2+循環(huán)的各種Ca2+調(diào)節(jié)蛋白中，肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum calcium ATPase2a，SERCA2a)的蛋白水平和活化程度是細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)

3、態(tài)的決定性因素。SERCA2a表達降低和活化程度下降是心力衰竭心肌舒縮功能異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究表明，轉(zhuǎn)基因過表達SERCA2a可以提高心臟的泵血功能，改善血流動力學狀況。最近有研究證實，過表達SERCA2a還可以延緩心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生，但具體機制尚未闡明?；谝酝芯考艾F(xiàn)有文獻報道，我們推測過表達SERCA2a可能有助于減輕心肌缺血缺氧造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，具有保護心肌細胞的作用。本研究在離體細胞水平，觀察缺氧情況下心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

4、應激的主要過程。以重組病毒rAd-SERCA2a為載體，觀察過表達SERCA2a對缺氧誘導心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及相關(guān)凋亡途徑的影響。旨在為過表達SERCA2a的基因治療方法應用于缺血性心力衰竭提供理論基礎(chǔ)。
　　 首先，本研究利用人胚胎腎細胞(HEK293細胞)擴增重組腺病毒rAd-SERCA2a及rAd-GFP，并通過Touchdown-PCR鑒定，證實重組入腺病毒基因的正確性。利用攜帶報告基因的重組腺病毒rAd-GFP轉(zhuǎn)染心肌

5、細胞，以及利用乳酸脫氫酶(LDH)觀察轉(zhuǎn)染對心肌細胞損傷程度，確定最佳的MOI值。為開展基因靶向性轉(zhuǎn)染心肌細胞打下基礎(chǔ)。
　　 其次，將體外培養(yǎng)的心肌細胞進行缺氧處理，觀察不同時間內(nèi)心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的情況。采用Western blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志性蛋白GRP78、CHOP、Caspase-12表達變化，DNA ladder及流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，心肌細胞缺氧6h后GRP78蛋白表達水平逐漸升高

6、，至缺氧24h達峰值，隨后表達有所下降。說明缺氧能夠誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78表達升高，但其表達水平具有一定的時效性。即缺氧早期(24h內(nèi))，GRP78蛋白表達豐度逐漸增加，其對細胞的保護作用也逐漸增強，而持續(xù)長時間缺氧(24h以上)，GRP78表達相對下降，對細胞的保護作用減弱。缺氧12h后凋亡因子CHOP和Caspase-12蛋白表達逐漸增加，36h后表達水平顯著升高。流式細胞術(shù)檢測顯示，隨著缺氧時間的延長，心肌細胞凋亡率逐漸上升

7、。提示缺氧誘導心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并且隨著缺氧時間延長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞保護機制轉(zhuǎn)向細胞損傷機制，心肌細胞最終發(fā)生凋亡。
　　 隨后，以重組腺病毒載體過表達SERCA2a后，再給予缺氧或衣霉素刺激，觀察過表達SERCA2a對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與缺氧組比較，SERCA2a+缺氧組GRP78表達無明顯變化，但是CHOP蛋白表達水平明顯下降，而Caspase-3蛋白表達也較缺氧組降低39.7％。SERCA2

8、a+缺氧組的細胞凋亡率較缺氧組明顯降低(P<0.05).提示過表達SERCA2a蛋白可減輕缺氧誘導心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的強度，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的心肌細胞損傷具有重要的防護作用。其作用機制：過表達SERCA2a雖然不能提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子伴侶GRP78等保護性蛋白的表達水平，但是可以抑制凋亡因子CHOP、Caspase-3等表達，進而減輕心肌細胞凋亡。
　　 最后，利用Fura-3和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)游離Ca2+的變化。結(jié)果顯