醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、研究背景：腦血管疾病是目前危害人類健康的三大疾病之一，其中，缺血性腦血管疾病以其高發(fā)病率，高致殘率和高死亡率，而嚴(yán)重危害著人們的身體健康。 腦缺血損傷以往認(rèn)為是由急性能量衰竭導(dǎo)致的細(xì)胞壞死所造成的，但腦循環(huán)障礙未進(jìn)一步加重時(shí)，神經(jīng)功能缺損仍進(jìn)行性加重，神經(jīng)元的急性壞死顯然無(wú)法解釋，從以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到，這種延遲損傷的機(jī)制主要為凋亡。20世紀(jì)90年代以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)腦缺血后神經(jīng)損傷中除壞死外，還存在凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡是造成腦缺血再灌

2、注后遲發(fā)性持續(xù)神經(jīng)細(xì)胞損傷不可忽視的重要因素。隨著研究的深入，凋亡在腦缺血再灌注損傷中的地位越來(lái)越明顯，其發(fā)展進(jìn)程直接關(guān)系到腦損傷程度和梗死范圍，并影響患者的預(yù)后和功能恢復(fù)。 從我國(guó)國(guó)情看，當(dāng)患者發(fā)生腦血管意外后送至醫(yī)院，待診斷明確，往往已失去溶栓治療的最佳時(shí)機(jī)，故缺血性腦血管病的治療成功率一直很低，缺血中心區(qū)的壞死發(fā)生較早，這部分腦組織的挽救相當(dāng)困難。而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死已終止，凋亡仍在進(jìn)行，故當(dāng)前世界上對(duì)缺血性腦損害的防治

3、重點(diǎn)己從溶栓治療轉(zhuǎn)向?qū)θ毖氚祬^(qū)神經(jīng)元的缺血再灌注損傷的保護(hù)。另一方面，在危重病例的救治過(guò)程中，如心肺驟停復(fù)蘇后，嚴(yán)重休克糾正后，亦都存在著腦缺血再灌注的問(wèn)題。 腦缺血再灌注損傷的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程，目前尚未完全闡明。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在大量的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，提出了多種學(xué)說(shuō)：如氧化應(yīng)激反應(yīng)學(xué)說(shuō)，炎癥反應(yīng)，細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)，鈣超載學(xué)說(shuō)，細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)以及興奮性氨基酸學(xué)說(shuō)等。腦缺血再灌注過(guò)程中可產(chǎn)生大量的氧自由基，造成脂質(zhì)，蛋白質(zhì)

4、和核酸過(guò)氧化，細(xì)胞膜破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。氧自由基尤其是超氧陰離子是局灶性腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的主要因素。 醒腦靜注射液是我國(guó)著名中藥安宮牛黃丸的精制靜脈注射液。臨床上主要用于各種昏迷和腦血管意外病人，效果顯著。多位學(xué)者采用格拉斯哥昏迷積分，評(píng)價(jià)其對(duì)急性腦血管病意識(shí)障礙具有促醒作用，但其作用機(jī)制往往是沿用中醫(yī)理論解釋，限制了其使用范圍，尤其是難以向國(guó)外醫(yī)學(xué)界推廣。 我們推測(cè)，醒腦靜的這種臨床作用，是否能防止在腦缺血

5、再灌注損傷中占重要地位的凋亡進(jìn)程，以及其能否抑制在腦缺血再灌注過(guò)程中引發(fā)的超乎尋常的過(guò)氧化反應(yīng)。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)，擬從通過(guò)觀察大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性的變化和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，探討醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制。 研究目的：通過(guò)觀察大鼠腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的變化和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，探討醒腦靜注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)

6、制。 研究方法：1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑：健康雄性SD大鼠100只，體重200～250g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。醒腦靜注射液，由無(wú)錫健宏藥業(yè)有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；凋亡檢測(cè)試劑盒由德國(guó)寶靈曼公司提供。 2、實(shí)驗(yàn)方法：采用Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。隨機(jī)將100只SD雄性大鼠分為13組：假手術(shù)組4只，醒腦靜組和對(duì)照組分別為缺

7、血再灌注2、4、8、24、48、72小時(shí)各6組，每組8只。于缺血同時(shí)醒腦靜組大鼠給予腹腔注射醒腦靜注射液1mi/100g/day，對(duì)照組腹腔注射同等量的生理鹽水，假手術(shù)組其它操作同對(duì)照組，插線深度為10mm。 3、標(biāo)本采集和檢測(cè)：每組于再灌注相應(yīng)的時(shí)間后快速斷頭處死，完整剝?nèi)∧X組織，其中每組的半數(shù)用于腦組織勻漿液的SOD、MDA檢測(cè)，另半數(shù)用于凋亡染色。SOD、MDA測(cè)定：所有腦組織勻漿液標(biāo)本集中統(tǒng)一用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD；

8、用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA，嚴(yán)格按試劑盒操作步驟完成；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞。于缺血周邊區(qū)不重復(fù)隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率(凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％)。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有6只大鼠考慮因麻醉意外死亡，補(bǔ)充6只進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，最后

9、進(jìn)入結(jié)果分析的大鼠為100只。 1、腦組織勻漿液SOD和MDA的變化：與假手術(shù)組相比，缺血再灌注后，醒腦靜組和對(duì)照組的腦組織勻漿液SOD活性明顯下降；MDA濃度顯著升高。醒腦靜組上述兩項(xiàng)指標(biāo)的變化與對(duì)照組相比明顯減弱，有顯著性差異；動(dòng)態(tài)觀察可見(jiàn)：SOD，MDA的改變從再灌注早期即出現(xiàn)，2小時(shí)即有明顯增高，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，這種改變更明顯，至24小時(shí)后出現(xiàn)回落。 2、凋亡染色檢測(cè)結(jié)果：缺血再灌注對(duì)側(cè)腦組織(左側(cè))和

10、假手術(shù)組腦片中未出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡；腦缺血再灌注后2小時(shí)內(nèi)亦未見(jiàn)有凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，于再灌注后4小時(shí)開始出現(xiàn)，凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性增高，一直至72小時(shí)未見(jiàn)有下降趨勢(shì)；凋亡細(xì)胞主要分布在缺血半暗帶區(qū)，細(xì)胞縮小，變形，濃染，呈深藍(lán)色。使用醒腦靜后，醒腦靜組較相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組凋亡細(xì)胞減少，有顯著性差異。 結(jié)論：腦缺血再灌注能使體內(nèi)氧化系統(tǒng)被激活，腦組織中氧自由基水平升高，參與腦缺血再灌注損傷，神經(jīng)元凋亡是這種損傷的重要形式