三株新城疫病毒抗人喉癌作用的比較研究.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬副黏病毒科(Paramyxoviridae)腮腺炎病毒屬(Paramyxovirus)成員，對(duì)禽類具有高度的致病性，在極少數(shù)情況下可以感染人類，表現(xiàn)為輕微的結(jié)膜炎或溫和的呼吸道癥狀[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NDV在人類腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制效率是在正常細(xì)胞中的10000倍[2]，這使得人們將它作為潛在的抗癌生物制劑[3]。目前，NDV治療腫瘤已經(jīng)成為一種輔助及另類醫(yī)療方法(Comp

2、lementary and altemative medicine，CAM)用于人類癌癥的治療，并已被廣泛的研究[4]。 本研究通過(guò)MTT法、HE染色法、電鏡觀察法、免疫組化法、流式細(xì)胞儀技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，比較研究NDV D817株、NDV7793株和NDV La Sota疫苗株體外對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞及體內(nèi)對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制效應(yīng)，同時(shí)將這3株NDV作用于人喉部正常組織細(xì)胞以對(duì)它們的安全性進(jìn)行比較。

3、 材料和方法： 選取分離自香港的NDV D817株和江西鄱陽(yáng)的NDV7793株各1株及1株La Sota疫苗株，接種雞胚以擴(kuò)增病毒，48h后收取雞胚尿囊液，測(cè)定血凝效價(jià)≥1:1024后，調(diào)整病毒濃度至1×108 PFU/ml，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。常?guī)方法培養(yǎng)非洲綠猴腎細(xì)胞Vero-E6、人喉癌Hep-2細(xì)胞和人喉部正常組織細(xì)胞。將3株NDV病毒接種人喉癌Hep-2細(xì)胞進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并用Vero-E6細(xì)胞進(jìn)行蝕斑純化。得到純

4、化病毒后再次擴(kuò)增，檢測(cè)其HA效價(jià)，并用MTT法檢測(cè)3株病毒對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞及人喉部正常組織細(xì)胞的殺傷作用。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。每只裸鼠取1個(gè)注射點(diǎn)，用上述細(xì)胞懸液0.2ml/只注射于裸鼠皮下，接種后每天觀察有無(wú)腫瘤形成及注射點(diǎn)有無(wú)破潰紅腫，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)徑和短徑均達(dá)5mm后進(jìn)行隨機(jī)分組。通過(guò)醛化紅細(xì)胞法收集尿囊

5、液中的病毒顆粒，PBS稀釋至1×107PFU/ml作為NDV注射液，實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠瘤內(nèi)注射0.1ml。按規(guī)定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積大小及裸鼠體重，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。NDV注射6周后處死裸鼠，秤量瘤塊和脾臟重量，計(jì)算抑瘤率和脾臟指數(shù)，進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。腫瘤組織用10％的福爾馬林溶液固定，進(jìn)行HE染色，評(píng)價(jià)移植瘤細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下的病理變化；通過(guò)電鏡觀察移植瘤細(xì)胞的病理變化；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)移植瘤細(xì)胞的凋亡情況；通過(guò)免疫組化S-P兩步法檢測(cè)移植瘤中

6、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 本研究選用的3株NDV在體外均能在人喉癌Hep-2細(xì)胞中復(fù)制增殖，均能殺傷Hep-2細(xì)胞，而且殺傷效應(yīng)與病毒的作用劑量及作用時(shí)間成正比。在采用MTT法檢測(cè)3株NDV對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞及人喉部正常組織細(xì)胞的殺傷作用實(shí)驗(yàn)中，3株NDV殺傷腫瘤細(xì)胞作用均較強(qiáng)。當(dāng)病毒稀釋度為1×10-1時(shí)，NDV作用細(xì)胞60h后NDV D817株、NDV7793株和NDV La Sota株的殺傷率

7、分別為96.65％、94.95％和95.35％;3株NDV對(duì)人喉部正常組織細(xì)胞影響相對(duì)較小(60h殺傷率≤25％)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。72h后3株NDV的殺傷作用均出現(xiàn)不同程度的下降現(xiàn)象。在純化后病毒的蝕斑實(shí)驗(yàn)中，從3株NDV蝕斑出現(xiàn)的時(shí)間及PFU數(shù)量來(lái)看，NDV D817株出現(xiàn)蝕斑的時(shí)間最早，蝕斑數(shù)量最多，NDV7793株出現(xiàn)蝕斑的時(shí)間最晚，蝕斑數(shù)量最少，NDV La Sota株居中。 為了盡可能如實(shí)的評(píng)價(jià)3株NDV對(duì)腫瘤的

8、抑制增殖作用，本研究II期實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸鼠移植瘤模型，從體內(nèi)角度來(lái)研究3株NDV對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的影響。裸鼠在接種Hep-2細(xì)胞后平均約4d后在接種部位可見(jiàn)瘤塊生長(zhǎng)，接種12d后腫瘤長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)均可達(dá)5mm，移植瘤成瘤率為100％。在治療過(guò)程中，治療初各組腫瘤體積為：PBS陰性對(duì)照組平均腫瘤體積為(183.5±15.2)mm3，NDV D817組平均腫瘤體積為(175.4±19.4)mm3，NDV7793組平均腫瘤體

9、積為(176.9±18.7)mm3，NDV La Sota組平均腫瘤體積為(185.4±20.4)mm3，順鉑陽(yáng)性對(duì)照組平均腫瘤體積為(168.5±21.5)mm3，各實(shí)驗(yàn)組間腫瘤體積無(wú)顯著性差異。治療期間腫瘤體積逐漸增長(zhǎng)，其中PBS陰性對(duì)照組增長(zhǎng)速度最快，順鉑陽(yáng)性對(duì)照組最慢，NDV組居中。治療末，NDV組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組腫瘤體積顯著低于PBS陰性對(duì)照組(P<0.01)。治療結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤組織稱重，NDV D817組、NDV7793組、

10、NDV La Sota組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組的抑瘤率分別為56.7％、51.2％、39.4％和90.4％。 在裸鼠移植瘤治療的毒性實(shí)驗(yàn)中，PBS陰性對(duì)照組和NDV實(shí)驗(yàn)組裸鼠體重治療后較治療前稍有下降，治療后體重/治療前體重>0.8，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；順鉑陽(yáng)性對(duì)照組裸鼠治療后體重與治療前相比有顯著性降低(P<0.01)，治療后體重/治療前體重<0.8，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)該組裸鼠隨著治療的進(jìn)行活動(dòng)力出現(xiàn)明顯下降。在對(duì)荷瘤裸鼠臟器的

11、影響方面，NDV實(shí)驗(yàn)組裸鼠的脾臟重量和脾臟指數(shù)與PBS陰性對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異。順鉑陽(yáng)性對(duì)照組的脾臟重量和脾臟指數(shù)顯著低于PBS陰性對(duì)照組(P<0.01)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取NDV實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝臟切片觀察，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有明顯的病理變化。 實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)裸鼠腫瘤組織病理切片的觀察，發(fā)現(xiàn)NDV D817組腫瘤組織與PBS陰性對(duì)照組相比有較多的死亡區(qū)域：細(xì)胞體積變小、變圓，與臨近細(xì)胞脫離。高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞膜突起，呈發(fā)泡狀，核膜裂解，

12、核仁消失。與順鉑陽(yáng)性對(duì)照組相比，細(xì)胞破碎現(xiàn)象不明顯。流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)顯示，經(jīng)NDV處理后，移植瘤細(xì)胞周期處于G0/G1期細(xì)胞含量降低，S期細(xì)胞數(shù)減少，而G2/M期細(xì)胞則增加(P<0.01)，表明細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。免疫組化檢測(cè)裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況，顯示NDV7793組和NDV La Sota組瘤細(xì)胞胞質(zhì)棕黃色較PBS陰性對(duì)照組深，Bax蛋白表達(dá)率顯著高于PBS陰性對(duì)照組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

13、.01)。NDV7793組和NDV La Sota組Bcl-2蛋白的表達(dá)率與PBS陰性對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異。 結(jié)論： 1、實(shí)驗(yàn)所選3株NDV具有選擇性在人喉癌Hep-2細(xì)胞中復(fù)制增殖和殺傷癌細(xì)胞的作用，具備抗腫瘤生物治療的潛能。其中NDV D817株具有較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，NDV7793株和NDV La Sota株的抗腫瘤作用略低。 2、3株NDV病毒株均對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤有明顯的抑制作用。