晚期糖基化終產(chǎn)物對足細胞自噬軸的影響.pdf

1、背景:
　　隨著時代的快速發(fā)展人類社會生活水平不斷提高，糖尿病的患病率在發(fā)展中國家的增長速度快速提高。在腎臟疾病領(lǐng)域，隨之而來的是一大人類健康殺手-糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)呈逐年上升的趨勢不斷增加，現(xiàn)如今全世界范圍內(nèi)約50％的終末期腎衰竭(End-stage renal disease，ESRD)患者來源于DN，是構(gòu)成ESRD重要的組成部分。較之20世紀(jì)，目前越來越多的患者需要腎臟替代治療來維持

2、生命，為區(qū)域經(jīng)濟帶來了嚴(yán)重的負擔(dān)。因此，及早干預(yù)、延緩DN的進展顯得尤為重要。晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)是DN進展中一個關(guān)鍵致病因子，在介導(dǎo)DN足細胞損傷中發(fā)揮著重要作用。然而，AGEs介導(dǎo)足細胞損傷的具體機制至今尚未明確。
　　本研究擬從動態(tài)的角度來深入探討AGEs對足細胞自噬軸活性的影響，探討可能的分子機制并研究AGEs導(dǎo)致的足細胞損傷與自噬軸活性改變之間的聯(lián)系

3、。從而為DN未來的治療策略提供新的線索。
　　方法:
　　一、糖基化牛血清白蛋白(advanced glycation end products-modified bovine serumalbumin，AGE-BSA)的制備及純化
　　（一）AGE-BSA的制備
　　采用0.2M PBS配置含有40 mg/mL BSA與90 mg/mL葡萄糖溶液，采用0.22um的過濾器過濾除菌后在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育90天

4、。對照BSA(co-BSA)不加葡萄糖，余處理同上。
　?。ǘ〢GE-BSA的純化
　　AGE-BSA與co-BSA孵育結(jié)束后置換出0.2 M PBS并去除未結(jié)合的剩余葡萄糖。檢測新制備AGE-BSA的內(nèi)毒素和糖基化水平后采用BCA法測定其濃度。
　　二、小鼠足細胞培養(yǎng)、鑒定及處理分組
　?。ㄒ唬┬∈笞慵毎囵B(yǎng)
　　條件永生化足細胞系(MPC)復(fù)蘇后用含10％ FBS的RPMI-1640和20-100U/

5、mL重組小鼠γ干擾素在5％CO2，33℃環(huán)境下誘導(dǎo)傳代增殖。然后轉(zhuǎn)入5％CO2，37℃培養(yǎng)箱，在37℃培養(yǎng)箱中用不含重組小鼠γ干擾素的RPMI-1640加5％ FBS在包被有Ⅰ型鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)分化。經(jīng)8-12d的培養(yǎng)誘導(dǎo)，足細胞進入分化階段并最終分化成熟。
　　（二）小鼠足細胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定
　　將33℃培養(yǎng)箱及37℃培養(yǎng)箱中的足細胞在倒置相差顯微鏡下拍片，并觀察比較兩者之間的形態(tài)學(xué)差異;采用足細胞特異性骨架蛋白s

6、ynaptopodin染色確定足細胞是否已分化成熟，成熟足細胞表達并延細胞骨架分布。本實驗所有足細胞實驗均在分化成熟后進行。
　?。ㄈ┏墒熳慵毎奶幚矸纸M
　　三、檢測內(nèi)容
　　檢測足細胞活動性;Podocin、LC3Ⅱ、P62的蛋白水平;mTORC1的活性水平;自噬體數(shù)目變化。
　　四、統(tǒng)計學(xué)處理
　　計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間結(jié)果

7、比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。方差齊采用LSD-t法進行組間多重比較，方差不齊采用Dunnett's T3法進行組間多重比較。如總體比較具有統(tǒng)計學(xué)差別，進一步進行兩兩比較。雙側(cè)P＜0.05定義為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　一、AGE-BSA足細胞損傷模型的建立
　?。ㄒ唬￤estern blot檢測AGE-BSA對足細胞標(biāo)志蛋白Podocin的表達水平的影響
　　足細胞分化成熟后將

8、足細胞分為對照組、co-BSA組、AGE-BSA組。干預(yù)結(jié)束后采用Western blot檢測podocin的蛋白水平。結(jié)果顯示AGE-BSA組較對照組Podocin蛋白水平明顯降低且有統(tǒng)計學(xué)差異，co-BSA組與對照組相比差別不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　（二）劃痕實驗檢測AGE-BSA對足細胞移動性的影響
　　足細胞培養(yǎng)成熟后分別通過劃痕實驗檢測上述分組對足細胞移動性的影響。結(jié)果顯示AGE-BSA組較對照組發(fā)生遷移的足細胞數(shù)目

9、明顯增多且有統(tǒng)計學(xué)差異，co-BSA組與對照組相比差別不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　二、建立足細胞自噬體生成活性動態(tài)檢測方法
　?。ㄒ唬￤estern blot檢測不同時間點氯喹處理后足細胞LC3Ⅱ及P62蛋白水平
　　足細胞培養(yǎng)成熟后將足細胞分為氯喹0h組、氯喹2h組、氯喹4h組、氯喹6h組，處理結(jié)束后采用Western blot檢測自噬體標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ。兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。氯喹(10μM)干預(yù)足細胞后LC3Ⅱ表達

10、水平均明顯升高且呈現(xiàn)出顯著的時間依賴性。采用同樣的方法檢測P62的蛋白水平，隨著氯喹(10μM)干預(yù)時間的延長，P62蛋白水平逐漸升高，也呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性，兩組間存在統(tǒng)計學(xué)上差異。
　?。ǘ┘す夤簿劢癸@微鏡及電鏡觀察不同時間點氯喹處理后足細胞自噬體數(shù)目改變
　　足細胞分化成熟后采用一定量的mRFP-GFP-LC3腺病毒感染足細胞，24h后給予氯喹干預(yù)0h、2h、4h、6h，細胞固定后應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察不同干預(yù)下

11、足細胞自噬體數(shù)目（自噬體呈現(xiàn)黃色，自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色）。氯喹0h組、氯喹2h組、氯喹4h組、氯喹6h組兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，隨氯喹干預(yù)時間的延長自噬體數(shù)目不斷累積。
　　分化成熟足細胞給予氯喹相應(yīng)處理后收集各處理組細胞，于電鏡下觀察各處理組足細胞自噬體數(shù)目。電鏡結(jié)果進一步證實隨著氯喹干預(yù)時間的延長，足細胞自噬體的數(shù)目逐漸增加（電鏡只用來定性，因此未行統(tǒng)計分析）。
　　三、AGE-BSA對足細胞自噬活性的影響
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12、一）AGE-BSA對足細胞自噬相關(guān)蛋白分子LC3Ⅱ、P62蛋白水平的影響
　　足細胞分化成熟后分為對照組、co-BSA組、AGE-BSA組，干預(yù)72h后采用Western blot檢測足細胞內(nèi)LC3Ⅱ的蛋白水平。AGE-BSA組較control組LC3Ⅱ蛋白水平明顯降低且有統(tǒng)計學(xué)差異，co-BSA組與對照組間不具有統(tǒng)計學(xué)差異。同樣采用Western blot檢測自噬軸活性相關(guān)蛋白P62的蛋白水平。AGE-BSA組較對照組P62蛋白

13、水平明顯上調(diào)且具有統(tǒng)計學(xué)差異，co-BSA組與對照組相比差別不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　（二）AGE-BSA對足細胞自噬體數(shù)目的影響
　　mRFP-GFP-LC3腺病毒感染足細胞，按上述處理干預(yù)足細胞后觀察足細胞自噬體。AGE-BSA組較對照組自噬體數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異。co-BSA組與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　（三）AGE-BSA抑制足細胞自噬體生成活性
　　將分化成熟足細胞分為對照組、氯喹2h

14、組、氯喹4h組、氯喹6h組、co-BSA組、co-BSA+氯喹2h組、co-BSA+氯喹4h組、co-BSA+氯喹6h組、AGE-BSA組、AGE-BSA+氯喹2h組、AGE-BSA+氯喹4h組、AGE-BSA+氯喹6h組。干預(yù)結(jié)束后采用Western blot檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ。AGE-BSA氯喹干預(yù)系列組較對照氯喹干預(yù)系列組LC3Ⅱ蛋白水平具有明顯下調(diào)趨勢，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。co-BSA加入氯喹干預(yù)組與對照氯喹干預(yù)組LC3

15、Ⅱ蛋白水平無明顯差異。
　　四、AGE-BSA對足細胞mTORC1活性的影響及其與足細胞受損自噬軸聯(lián)系
　?。ㄒ唬〢GE-BSA對mTORC1活性的影響
　　mTORC1活性通過其底物P70S6K的磷酸化水平來檢測。本實驗中將足細胞分化成熟后分為對照組、co-BSA組、AGE-BSA組，干預(yù)72h后采用Western blot檢測P70S6K及其磷酸化形式P-P70S6K蛋白水平，比較各組間P-P70S6K蛋白水平。A

16、GE-BSA組較對照組P-P70S6K蛋白水平明顯升高且有統(tǒng)計學(xué)差異，co-BSA組與對照組間不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　?。ǘ├着撩顾赝ㄟ^抑制AGE-BSA/mTORC1增強足細胞自噬活性并保護足細胞
　　(1)雷帕霉素通過抑制AGE-BSA/mTORC1增強足細胞自噬活性
　　本實驗在AGE-BSA干預(yù)的基礎(chǔ)上再給予雷帕霉素，AGE-BSA+雷帕霉素組較AGE-BSA組mTORC1活性明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時

17、AGE-BSA+雷帕霉素組較AGE-BSA組LC3Ⅱ蛋白水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)雷帕霉素通過抑制AGE-BSA/mTORC1保護足細胞
　　檢測LC3Ⅱ的同時，我們檢測了足細胞損傷標(biāo)志物Podocin的變化。AGE-BSA組在給予雷帕霉素處理后較未給予組Podocin蛋白表達水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　在AGE-BSA體外介導(dǎo)足細胞損傷模型中，mTORC1活化抑制足細