水稻抗條紋葉枯病的基因定位及其基因工程育種.pdf

1、水稻條紋葉枯病(RiceStripeDisease)是由水稻條紋病毒(RiceStripeVirus，RSV)引起的一種危害嚴(yán)重的水稻病毒病，通過灰飛虱刺吸以持久方式傳播。該病害在我國(guó)最早發(fā)生于1963年。從上世紀(jì)90年代末開始，由于粳稻品種種植面積不斷擴(kuò)大，再加上種植制度改變和暖冬年份連續(xù)出現(xiàn)等因素，使得一度沉寂的水稻條紋葉枯病在江蘇等地區(qū)又開始普遍發(fā)生，造成水稻大面積減產(chǎn)。過去對(duì)該病害的防治實(shí)踐表明，只有培育和使用抗耐病品種才是防治

2、該病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。而目前使用的抗病品種抗源基礎(chǔ)比較狹窄，主要是利用來自巴基斯坦秈稻Modan中的抗病基因Stv-bi，所以為了改變長(zhǎng)期依靠單個(gè)基因抗性的現(xiàn)狀，尋找新的抗病基因、培育優(yōu)良抗病新品種成為當(dāng)前防治水稻條紋葉枯病的首要任務(wù)。目前主要是通過傳統(tǒng)的雜交育種來選育抗病新品種，但效率較低而且抗病鑒定也比較困難，而利用現(xiàn)代的基因工程技術(shù)來快速改良高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)但感病的水稻品種則具有廣闊的應(yīng)用前景。所以本研究圍繞條紋葉枯病抗性育種開展了兩個(gè)方

3、面的研究：一是尋找并定位新的抗病基因；二是利用新的基因工程技術(shù)來培育轉(zhuǎn)基因抗病水稻。目前取得的研究結(jié)果如下：1、利用抗病親本秈稻Dular和感病親本粳稻Balilla雜交構(gòu)建的F2無性系群體，在2004和2005年，采用人工接蟲傳毒試驗(yàn)，分別以株系發(fā)病率和病級(jí)指數(shù)兩個(gè)指標(biāo)為表型值，鑒定兩個(gè)親本和226個(gè)F2無性系對(duì)RSV的抗性。利用WindowsQTLCartographer2.0定位軟件對(duì)RSV的抗性基因進(jìn)行檢測(cè)。以株系發(fā)病率為表型值

4、共檢測(cè)到3個(gè)QTLs，分別命名為qSTV-3、qSTV-11b、qSTV-11c。qSTV-3位于3號(hào)染色體標(biāo)記區(qū)間RM7324-RM3586，qSTV-11b和qSTV-11c位于11號(hào)染色體上兩個(gè)相鄰區(qū)間RM287-RM209和RM209-RM21。兩年重復(fù)試驗(yàn)定位的QTLs位置相同，但三個(gè)QTLs的LOD值和貢獻(xiàn)率在年度間有差異。在2004年，3個(gè)QTLs的LOD值分別為3.08、26.81、22.89，貢獻(xiàn)率分別為4.5％、46

5、.73％、41.09％；2005年3個(gè)QTLs的LOD值分別為2.51、14.53、13.50，貢獻(xiàn)率分別為3.73％、31.62％、26.21％。以病級(jí)指數(shù)為表型值也檢測(cè)到3個(gè)QTLs，分別命名為qSTV-11a、qSTV-11b、qSTV-11c。3個(gè)QTLs都位于第11染色體上，分別位于標(biāo)記區(qū)間RM1124-SSR20、RM287-RM209和RM209-RM21。兩年重復(fù)試驗(yàn)QTLs位置一致。2004年3個(gè)QTLs的LOD值和貢

6、獻(xiàn)率分別為7.51、11.58、8.40和28.69％、30.27％、25.41％；2005年3個(gè)QTLs的LOD值和貢獻(xiàn)率分別為7.22、11.34、10.42和46.48％、22.82％、20.1％。所有檢測(cè)到的QTLs均來自抗病親本秈稻品種Dular。對(duì)QTL定位分析可以看出，位于RM287-RM209和RM209-RM21間的qSTV-11b、qSTV-11c在兩種表型值下都被檢測(cè)到，且聯(lián)合效應(yīng)較高，經(jīng)與Stv-bi位置比較，可

7、以認(rèn)為其中一個(gè)是新的抗病基因。 2、為了進(jìn)一步確定這兩個(gè)連鎖抗病基因的染色體位置，利用F3群體和回交群體對(duì)它們進(jìn)行了精細(xì)定位。首先根據(jù)http//www.gramene.org/上公布的序列在RM287-RM21之間合成了一些新的引物，最后得到6對(duì)多態(tài)性標(biāo)記。使用8個(gè)多態(tài)SSR標(biāo)記RM287、RM7275、RM5960、RM5312、RM1355、RM209、RM6897、RM5349、RM21對(duì)部分典型感病植株進(jìn)行了分子檢測(cè)。

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RM287與RM21之間存在兩個(gè)交換斷點(diǎn)，說明在RM287與RM21之間確實(shí)存在兩個(gè)抗病位點(diǎn)。連鎖分析顯示，一個(gè)交換斷點(diǎn)發(fā)生在RM1355與RM209之間，與RM1355和RM209的遺傳距離分別為0.6cM和2.3cM；另一個(gè)交換斷點(diǎn)發(fā)生在RM6897與RM5349之間，與RM6897、RM5349的遺傳距離分別為2.8cM和1.1cM。在用這些標(biāo)記對(duì)感病植株進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)還發(fā)現(xiàn)在交換株中都只存在一個(gè)交換斷點(diǎn)，即感病植株在其

9、中一個(gè)交換點(diǎn)一側(cè)呈現(xiàn)純合感病親本帶型，另一側(cè)包括另外一個(gè)交換點(diǎn)呈現(xiàn)雜合帶型或純合抗病親本帶型。這些分子檢測(cè)結(jié)果暗示了這兩個(gè)抗病位點(diǎn)是通過互作產(chǎn)生抗性的，即在兩個(gè)抗病位點(diǎn)處只要有一個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)純合感病親本帶型，則該植株就表現(xiàn)為感病癥狀。接著利用水稻DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫中的關(guān)于Insertion/Deletions(InDels)的信息，設(shè)計(jì)新的STS分子標(biāo)記用于進(jìn)一步的定位。用6對(duì)多態(tài)STS標(biāo)記對(duì)感病交換株的檢測(cè)結(jié)果表明，qSTV-11b位于

10、標(biāo)記RM1355與STS11-31之間，與RM1355和STS11-31的遺傳距離分別為0.6cM、0.4cM；qSTV-11c位于標(biāo)記STS11-19與RM5349之間，與STS11-19和RM5349的遺傳距離分別為0.9cM、1.1cM。從http//www.gramene.org/上公布的水稻物理圖譜我們可以發(fā)現(xiàn)，RM1355所在的克隆AC135569與STS11-31所在的克隆AC136009之間還相隔兩個(gè)克隆AC124151

11、和AC150202，兩標(biāo)記間相距大約269.6kb，STS11-19所在的克隆AC135568與RM5349所在的克隆AC134925之間也相隔兩個(gè)克隆AC134256和AC133248，兩標(biāo)記間相距大約440.1kb。 3、分別利用條紋葉枯病毒的外殼蛋白(coatprotein，CP)和病害特異性蛋白(disease-specificprotein，SP)基因序列構(gòu)建了包含該基因反向重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的RNA干擾表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌

12、介導(dǎo)轉(zhuǎn)化兩個(gè)粳稻品種成熟胚獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。檢測(cè)結(jié)果表明獲得82株轉(zhuǎn)CP基因水稻幼苗，其中蘇御糯轉(zhuǎn)基因苗30株，3015轉(zhuǎn)基因苗52株；轉(zhuǎn)SP基因獲得的轉(zhuǎn)基因苗有89株，其中蘇御糯轉(zhuǎn)基因苗37株，3015轉(zhuǎn)基因苗52株。在對(duì)轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行接蟲鑒定抗性前對(duì)SP轉(zhuǎn)基因苗提取mRNA，以S1與S2為引物對(duì)所提mRNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)SP基因植株中SP基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。然后對(duì)所有的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行接蟲傳毒試驗(yàn)，待病情穩(wěn)定后調(diào)查抗性

13、，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)CP基因植株中，蘇御糯得到的5個(gè)轉(zhuǎn)化子，4個(gè)表現(xiàn)抗病，其中1個(gè)達(dá)到免疫，3015得到的8個(gè)轉(zhuǎn)化子，7個(gè)表現(xiàn)抗病，其中4個(gè)達(dá)到免疫；轉(zhuǎn)SP基因植株中，蘇御糯得到的5個(gè)轉(zhuǎn)化子，4個(gè)表現(xiàn)抗病，其中1個(gè)達(dá)到免疫，3015得到的7個(gè)轉(zhuǎn)化子，6個(gè)表現(xiàn)抗病，其中4個(gè)達(dá)到免疫。再對(duì)接種后的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明病毒RNA并沒有得到明顯的積累，說明轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)由于病毒基因反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生了發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，在病毒