牛Ⅰ型干擾素家族新成員(IFN-ε、IFN-κ、IFN-χ)抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、干擾素(interferons，IFN)是見(jiàn)于所有有頜類(lèi)脊椎動(dòng)物的一大類(lèi)多效應(yīng)細(xì)胞因子，主要擔(dān)負(fù)宿主抗病毒感染免疫應(yīng)答功能，不同的病原感染往往傾向于誘導(dǎo)表達(dá)出特定的干擾素成員，發(fā)現(xiàn)并系統(tǒng)鑒定干擾素新成員對(duì)抗病毒感染免疫應(yīng)答具有重要的意義。固有免疫是機(jī)體抵御病原入侵的第一道防線，抗病毒固有免疫反應(yīng)起始于細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體(PRRs)。PRRs識(shí)別的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)（尤其是IRF

2、3和IRF7）來(lái)進(jìn)一步誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，建立抗病毒狀態(tài)以促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，最終從機(jī)體內(nèi)清除病毒感染，所以Ⅰ型干擾素在建立抗病毒感染狀態(tài)和宿主細(xì)胞抵抗病毒復(fù)制方面具有重要的作用。
　　本研究首先系統(tǒng)分析了牛Ⅰ型干擾素基因座位，定位到牛的2個(gè)干擾素新亞型(IFN-ε、IFN-κ)以及1個(gè)包含有2個(gè)成員的新亞族（IFN-x1、IFN-x3），隨后圍繞這四種干擾素的抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了一系列的研究，具體研究?jī)?nèi)容如下:

3、>　　1.牛Ⅰ型干擾素基因座圖譜的構(gòu)建與分析。綜合運(yùn)用多種在線BLAST方法(BLAST，Basic Local Alignment Search Tool，基本的基于局部比對(duì)的搜索工具)對(duì)牛全基因組篩選，全面分析各型干擾素的信息，發(fā)現(xiàn)牛Ⅰ型干擾素基因排布于8號(hào)染色體上，并進(jìn)化出了具有鮮明特征的干擾素新家族，其中最為引人注目當(dāng)屬I(mǎi)FN-x亞族。IFN-x亞族具有4個(gè)成員，具備全新干擾素的特征，組成了1個(gè)新干擾素亞族。牛Ⅰ型干擾素基因座按

4、轉(zhuǎn)錄方向分成2個(gè)大的亞座位，長(zhǎng)度(746kp)分別是人(403kp)和鼠(323kb)的1.85和2.31倍，并且干擾素基因數(shù)目(64個(gè))也遠(yuǎn)超人（17個(gè)）與鼠（19個(gè)）。在座位末端5個(gè)IFN-δ假基因與4個(gè)IFN-x樣分子混雜在12個(gè)IFN-β樣基因之中，并且這些基因的轉(zhuǎn)錄方向均相同;基因座其它區(qū)域則被數(shù)量龐大的IFN-α（13個(gè)）和IFN-ω（24個(gè)）家族所占據(jù)。IFN-κ和IFN-ε僅存在1個(gè)拷貝序列，位于基因組的起始端，且IFN

5、-κ的轉(zhuǎn)錄方向與IFN-β相反，其與最近的干擾素基因間隔6.561Mb。
　　2.牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3的特性和抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究首先從牛肝基因組中克隆得到了牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3基因，并分析了這些序列的特征。隨后在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3的成熟肽序列，并制備了抗牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x多克隆抗體，

6、在不同的系統(tǒng)上測(cè)定了其抗病毒活性。牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3均對(duì)胰酶敏感，一定程度上耐熱（42℃和60℃）耐酸堿(pH2.0和pH10.0)，其抗病毒活性可被特異性多克隆抗體中和，也可被Ⅰ型干擾素受體IFNAR1和IFNAR2抗體阻斷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3不僅可誘導(dǎo)干擾素刺激基因(ISGs，如Mx1，ISG15，ISG56)的轉(zhuǎn)錄，也可誘導(dǎo)Mx1，STAT1，NF-

7、κB p65的表達(dá)，這些分析表明目前已知的Ⅰ型干擾素成員均依賴(lài)JAK-STAT信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)抗病毒信號(hào)。
　　3.牛IFN-ε、IFN-κ、IFN-x1、IFN-x3對(duì)干擾素信號(hào)通路的影響。本試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方式分析了在牛睪丸原代細(xì)胞上牛IFN-αA和IFN-x1的調(diào)控基因并比較了這些基因的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛BoIFN-x1樣品處理組有40個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào);BoIFN-αA樣品處理組有80個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)

8、。隨后采用熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了這些調(diào)控基因的在牛源細(xì)胞上的表達(dá)調(diào)控，結(jié)果顯示上調(diào)基因大部分屬于ISGs基因，隨機(jī)選取OAS、Mx1，STAT1、LGP2、GBP4、BST2、PML基因在MDBK、BT、BL細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)這些基因在不同細(xì)胞上均有不同程度的上調(diào)。此外，牛Ⅰ型干擾素可在BL和BT細(xì)胞上啟動(dòng)商品化的人NF-κB-Luc和ISRE-Luc報(bào)告載體的熒光素酶活性，并可激活本研究構(gòu)建的BoIFNβ-Luc和BoIFNx-

9、Luc啟動(dòng)子報(bào)告載體的熒光素酶活性，為進(jìn)一步開(kāi)展牛固有免疫信號(hào)通路的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　4.牛干擾素信號(hào)通路相關(guān)分子的研究。維甲酸誘導(dǎo)基因(RIG-Ⅰ)、黑素瘤分化相關(guān)因子5(MDA5)是胞內(nèi)識(shí)別dsRNA的重要模式識(shí)別受體，IRF3和IRF7是參與固有免疫應(yīng)答的重要轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子IRF9參與誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，ELF4、MAVS、MITA作為信號(hào)通路中的接頭分子參與誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。本研究運(yùn)用RT-PCR的方法從犢牛

10、原代腎細(xì)胞中克隆獲得了牛接頭分子ELF4、MAVS、MITA的cDNA，并分析了其序列特征，組織表達(dá)和細(xì)胞器定位，重點(diǎn)研究了其對(duì)干擾素信號(hào)通路的影響。研究表明在不同的細(xì)胞上接頭分子ELF4、MAVS、MITA能誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的Ⅰ型干擾素，促進(jìn)信號(hào)通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，還能刺激ISRE、NF-κB、BoIFN-β和BoIFN-x啟動(dòng)子激活的熒光素酶活性，為今后進(jìn)一步探討接頭分子ELF4、MAVS、MITA在牛感染性疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)

11、。
　　除了接頭分子ELF4、MAVS、MITA基因外，本研究還相繼克隆得到了牛干擾素信號(hào)通路中的重要分子MDA5、IRF3、IRF7、IRF9、DAI，這為今后研究牛固有免疫奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究牛病原與宿主相互作用提供便利工具。
　　5.3Cpro、Lbpro在牛源細(xì)胞上對(duì)干擾素信號(hào)通路的影響。首先分析了不同刺激物在不同細(xì)胞上對(duì)Ⅰ型干擾素及信號(hào)通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)合已有的研究證實(shí)FMDV可以拮抗宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生

12、，F(xiàn)MDV的3Cpro和Lpro可以作用在不同的靶分子上來(lái)逃避宿主的固有免疫應(yīng)答，拮抗Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)3Cpro和Lpro不但能抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，抑制接頭分子ELF4、MAVS，RIG-Ⅰ樣受體RIG-Ⅰ、MDA5，轉(zhuǎn)錄因子IRF3、IRF7的轉(zhuǎn)錄，還能抑制Ⅰ型干擾素和接頭分子ELF4、MAVS、MITA激活的NF-κB、ISRE、BoIFN-β、BoIFN-x啟動(dòng)子活性。Western Blot結(jié)果證實(shí)在BT和M

13、DBK細(xì)胞上3Cpro和Lpro可以抑制poly(I∶C)和BoIFN-β誘導(dǎo)的NF-κB p65、Mx1、IRF3、IRF7、ELF4、MAVS的表達(dá)。
　　總之，本研究系統(tǒng)分析了牛Ⅰ型干擾素新成員IFN-ε、IFN-κ、IFN-x的分子特征和生物學(xué)功能，初步建立了牛固有免疫信號(hào)通路研究的技術(shù)平臺(tái)，利用該平臺(tái)重點(diǎn)分析了接頭分子ELF4、MAVS、MITA對(duì)干擾素信號(hào)通路的影響，系統(tǒng)地分析了口蹄疫病毒3Cpro、Lbpro逃避固有