非綜合征性前庭水管擴(kuò)大患者拷貝數(shù)變異、KCNJ10基因的篩查及基因表達(dá)的研究.pdf

1、非綜合征性前庭水管擴(kuò)大（non-syndromic Enlarged Vestibular Aqueduct，EVA）是一種最常見(jiàn)的內(nèi)耳畸形，其在感音神經(jīng)性聾的患者中約占10％左右。臨床表現(xiàn)為學(xué)齡前發(fā)病的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，部分患者存在有低頻骨氣導(dǎo)差，表現(xiàn)為混合性聽(tīng)力損失；其聽(tīng)力損失從輕度到極重度不等，聽(tīng)力常呈現(xiàn)波動(dòng)性或進(jìn)行性下降，最終達(dá)重度或極重度，從而影響語(yǔ)言的學(xué)習(xí)或正常的交流。前庭水管擴(kuò)大的患者在聽(tīng)力下降前常有感冒、發(fā)熱、輕微頭部

2、外傷或其它使顱內(nèi)壓增高的誘發(fā)因素，因此對(duì)于該病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)成為預(yù)防或推遲其發(fā)病的有效措施。前庭水管擴(kuò)大是一種常染色體隱性遺傳性疾病，其與染色體7q31上的SLC26A4基因突變有密切關(guān)系。在前庭水管擴(kuò)大的患者中，約有65～92％的患者可以檢測(cè)到該基因的突變。SLC26A4基因?qū)儆陉庪x子轉(zhuǎn)運(yùn)家族，有12個(gè)跨膜區(qū)，N末端和C末端位于細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)于甲狀腺、腎臟和內(nèi)耳。介導(dǎo)硫酸根、碳酸氫根、甲酸根、草酸根、氫氧根、氯、碘及果糖

3、等多種單價(jià)或二價(jià)的離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，在機(jī)體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。當(dāng)SLC26A4基因發(fā)生突變后，突變體的蛋白表達(dá)及功能均發(fā)生變化，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。隨著對(duì)SLC26A4基因研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)該基因突變具有很大的異質(zhì)性：包括基因突變的形式、基因突變發(fā)生的位點(diǎn)及不同種族該基因突變圖譜等均存在有很大的異質(zhì)性。近年來(lái)的研究表明雖然非綜合征性前庭水管擴(kuò)大和SLC26A4基因突變有密切的關(guān)系，但國(guó)內(nèi)外的研究均發(fā)現(xiàn)在相當(dāng)一部分前庭水管擴(kuò)大的

4、病人中，未找到SLC26A4基因突變或僅找到一個(gè)單等位基因突變。為了明確這部分病人的致病機(jī)理；探討其它遺傳因素在這部分病人的耳聾發(fā)病中的作用，本課題研究了拷貝數(shù)變異和參與內(nèi)淋巴鉀離子調(diào)節(jié)的基因-KCNJ10基因突變?cè)诜蔷C合征性前庭水管擴(kuò)大的發(fā)病中的作用。為完善耳聾基因診斷的程序和方法提供依據(jù)。同時(shí)針對(duì)中國(guó)人群所特有的SLC26A4突變圖譜，選取了幾種常見(jiàn)的熱點(diǎn)突變，進(jìn)行了SLC26A4基因突變后的表達(dá)研究，以期為進(jìn)一步探索SLC26A4

5、基因突變的致病分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分 應(yīng)用MLPA方法對(duì)非雙等位基因突變的SLC26A4基因拷貝數(shù)變異的篩查
　　 拷貝數(shù)變異（CNVs）是指在人類基因組中廣泛存在的，從1000bp到數(shù)百萬(wàn)bp范圍內(nèi)的缺失、插入、重復(fù)和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異。是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在人類基因組中除SNPs之外，另一類豐富的多態(tài)性來(lái)源，CNVs除廣泛存在于正常個(gè)體的基因組中，也與染色體重組和一些遺傳性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。常規(guī)的一些檢測(cè)技術(shù)

6、無(wú)法檢測(cè)到CNVs的存在。
　　 為了解拷貝數(shù)變異是否在非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的發(fā)病機(jī)制中起作用，本部分研究應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)對(duì)解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心所收集到的非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的患者中沒(méi)有檢測(cè)到SLC26A4基因任何突變及僅檢測(cè)到單個(gè)等位基因突變的患者進(jìn)行SLC26A4基因拷貝數(shù)變異的篩查，尋找可能

7、存在的致病性的拷貝數(shù)變異。在39例未找到SLC26A4基因突變及68例僅找到SLC26A4單等位基因突變的非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的病人中；均未發(fā)現(xiàn)有明顯的拷貝數(shù)變異的存在?；谠囼?yàn)結(jié)果我們推斷有以下幾種可能：①SLC26A4基因的外顯子中確實(shí)不存在有拷貝數(shù)變異；因此拷貝數(shù)變異不構(gòu)成非綜合征性大前庭水管擴(kuò)大的致病機(jī)制。②SLC26A4基因中存在有拷貝數(shù)的變異，但這些拷貝數(shù)變異沒(méi)有存在于開(kāi)放閱讀框架區(qū)，而是存在于內(nèi)含子區(qū)或上、下游的調(diào)控區(qū)等

8、部位，用現(xiàn)有的MLPA檢測(cè)試劑盒無(wú)法檢測(cè)到。③在SLC26A4基因周圍或其他對(duì)SLC26A4起調(diào)控作用的基因中，存在有拷貝數(shù)變異，這些拷貝數(shù)變異通過(guò)改變這些基因的表達(dá)或功能，間接地影響SLC26A4基因，從而導(dǎo)致非綜合性前庭水管擴(kuò)大的出現(xiàn)。
　　 本研究首次將CNVs應(yīng)用于非綜合征性前庭水管擴(kuò)大病人的基因篩查，為非綜合征性前庭水管擴(kuò)大病人的基因診斷提供了一個(gè)新的視角，從而完善該病的基因診斷。
　　 第二部分 非綜合征性前

9、庭水管擴(kuò)大患者KCNJ10基因突變的篩查
　　 KCNJ10基因位于人類染色體1q23，編碼一種內(nèi)向整流性鉀離子通道，主要表達(dá)在大腦，內(nèi)耳和腎臟。在內(nèi)耳中，KCNJ10基因編碼的鉀離子通道主要表達(dá)在血管紋，對(duì)于耳蝸電位（EP）的形成起重要作用，血管紋產(chǎn)生耳蝸電位（EP）并向耳蝸內(nèi)淋巴分泌鉀離子。耳蝸電位是耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)電流的主要驅(qū)動(dòng)力量；鉀離子電流是最主要的耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)電流。耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)電流產(chǎn)生了聽(tīng)力。KCNJ10突變可以導(dǎo)致耳蝸電位的消失，

10、從而導(dǎo)致聽(tīng)力的損失。近年來(lái)的研究表明在Pendred綜合征和非綜合征性的前庭水管擴(kuò)大中有KCNJ10基因突變的存在，由此推測(cè)KCNJ10基因突變?cè)诜蔷C合征性的前庭水管擴(kuò)大的發(fā)病機(jī)制中起作用。
　　 為了解KCNJ10基因突變是否在非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的發(fā)病機(jī)制中起作用，本部分研究對(duì)解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心所收集到的非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的患者進(jìn)行了KCNJ10基因突變的篩查。在107例攜帶SLC26A4單雜合突變及未檢測(cè)到

11、突變的病例中，共檢測(cè)到3例KCNJ10基因突變，其中有812 G>A雜合突變2例，1042 C>T雜合突變1例。在311例已篩查到SLC26A4基因雙等位基因突變（純合突變和復(fù)合雜合突變）患者中共篩查到12例KCNJ10突變；其中812G>A雜合突變11例；1042C>T雜合突變1例。在229例正常人中共篩查到14例KCNJ10突變；其中812G>A雜合突變11例，1042C>T雜合突變2例，811C>T雜合突變1例。對(duì)那些帶有SLC2

12、6A4雙等位基因突變，同時(shí)又帶有KCNJ10基因突變患者的父母進(jìn)行上述兩個(gè)基因的篩查，結(jié)果表明其父母中必有一方為同時(shí)帶有SLC26A4和KCNJ10單雜合的攜帶者，但是臨床癥狀卻表現(xiàn)正常，既沒(méi)有聽(tīng)力的下降，也沒(méi)有前庭水管的擴(kuò)大。這同國(guó)外有關(guān)研究的觀點(diǎn)截然不同。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們初步得出以下幾種推論：①KCNJ10的單雜合突變?cè)谥袊?guó)人群中是一種普遍存在的現(xiàn)象；②中國(guó)人群中KCNJ10最常見(jiàn)的突變類型是812G>A；③KCNJ10雖然在耳

13、蝸電位及聽(tīng)覺(jué)形成過(guò)程中起重要作用，但KCNJ10的單雜合突變和Pendred綜合征及非綜合征性前庭水管擴(kuò)大之間并沒(méi)有必然的聯(lián)系；④KCNJ10和SLC26A4的復(fù)合雜合突變不一定導(dǎo)致Pendred綜合征或非綜合征性前庭水管擴(kuò)大：對(duì)于同時(shí)有SLC26A4和KCNJ10基因單雜合突變的非綜合征性前庭水管擴(kuò)大患者，其致病原因有可能并不是由KCN110突變引起的，而有可能是由于其他原因，如另一種目前我們尚未知的基因突變或環(huán)境與基因的相互作用引起

14、的。
　　 本研究初步分析了KCNJ10與非綜合征性前庭水管擴(kuò)大之間的關(guān)系，表明了KCNJ10基因突變和非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的發(fā)生沒(méi)有必然的聯(lián)系，為完善非綜合征性前庭水管擴(kuò)大的基因診斷提供了依據(jù)。
　　 第三部分 中國(guó)人群中非綜合征性前庭水管擴(kuò)大患者常見(jiàn)的SLC26A4基因突變的表達(dá)研究
　　 SLC26A4基因突變可引起Pendred綜合征或非綜合征性前庭水管擴(kuò)大。SLC26A4基因突變具有很大的異質(zhì)性?；?/p>

15、突變的形式，不同種族該基因突變圖譜等均存在有很大的異質(zhì)性。這些異質(zhì)性提示SLC26A4突變后其致病的分子機(jī)制有可能也存在一定的異質(zhì)性。中國(guó)人群中SLC26A4突變圖譜和世界上其他人群的突變圖譜有著明顯的不同。在中國(guó)人群中常見(jiàn)的幾種熱點(diǎn)突變類型是IVS7-2A>G；2168A>G（H723R）：1174A>T（N392Y）；1229C>T（T410M）；2027T>A，而這些突變引起的分子功能改變的具體機(jī)制目前為止尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究

16、即以中國(guó)人群中最常見(jiàn)的突變類型為研究對(duì)象，構(gòu)建上述幾種常見(jiàn)的SLC26A4突變質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，以觀察其突變發(fā)生后在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在本實(shí)驗(yàn)中所選取的四種SLC26A4基因突變發(fā)生后，其編碼的Pendrin蛋白均滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而野生型Pendrin蛋白則表達(dá)于細(xì)胞膜上，由此推測(cè)SLC26A4突變發(fā)生后，其編碼的Pendrin蛋白無(wú)法定位于胞膜上，而滯留于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，無(wú)法完成正常的陰離子交換功能，從而導(dǎo)致疾病