克雷伯氏菌屬多重耐藥現(xiàn)狀及qnrA和氟喹諾酮耐藥的關系研究.pdf

1、肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌，也是院內(nèi)感染的重要致病菌，毒力強，致死率高。一直是臨床微生物學家關注的重要病原菌。近年來，其耐藥性快速增加，常有該菌引起醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)的報道。由于其多重耐藥性，給治療帶來很大困難，除了主要對β-內(nèi)酰胺類耐藥以外，對喹諾酮類抗菌藥也嚴重耐藥。喹諾酮類抗菌藥物(QNs)是近20年來發(fā)展十分迅速的一類抗菌藥物，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第四代，因其抗菌譜廣、抗菌活性強、使用方便、劑型較多等優(yōu)點，在國內(nèi)外臨床控制感染性疾

2、病中已普遍應用，其用量僅次于頭胞菌素類和青霉素類。有報道顯示有90％的醫(yī)生把氟喹諾酮作為泌尿道感染的首選藥，因而造成了耐藥性的產(chǎn)生。細菌獲喹諾酮類藥物耐藥的機制主要有三方面：1.藥物作用靶位的結(jié)構(gòu)基因突變致脫氧核糖核酸旋轉(zhuǎn)酶(DNA促旋酶)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ突變。2.細菌細胞膜通透性改變。3.控制細菌主動外排系統(tǒng)的調(diào)控基因突變而致主動外排增強。近年JohnH等[12]發(fā)現(xiàn)了可編碼喹諾酮耐藥的多重耐藥質(zhì)?；騫nr(qnrA，qnrB,qnr

3、S)，以qnrA研究最多，實驗研究它可以保護DNA促旋酶DNAgyrase不受環(huán)丙沙星抑制。此基因可隨質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而傳遞，導致細菌的耐藥性轉(zhuǎn)移，引起臨床醫(yī)生高度重視。 國內(nèi)目前對肺炎克雷伯菌的ESBLs、AmpC等產(chǎn)酶問題研究較多，而對其耐氟喹諾酮類藥物研究較少。本研究對肺炎克雷伯菌多重耐藥分布進行了分析，為臨床治療提供依據(jù)；對耐喹諾酮抗菌藥株的靶酶進行研究，以期發(fā)現(xiàn)新的突變位點；篩查質(zhì)粒，對發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導的耐藥株進一步研究其耐藥機理

4、。 1.克雷伯菌屬多重耐藥現(xiàn)狀分析 收集中山大學附一院臨床細菌檢驗室2004年1月1日至12月31日分離培養(yǎng)的克雷伯菌223株，均經(jīng)過VITEK-ASI60型全自動細菌鑒定、藥敏分析系統(tǒng)bioMérieux(生物梅里埃)公司產(chǎn)品)鑒定(具體操作按其說明書)。藥敏紙片方法測菌株耐藥性，NCCLS推薦的表型篩選試驗和表型確認試驗檢測ESBLs。在CIP耐藥菌株中隨機抽取60株進一步用濃度梯度法(E-test法)做MIC，藥敏

5、參照2004年美國臨床實驗室標準化委員(NCCLS)標準。 223株克雷伯菌中產(chǎn)酸克雷伯有4株，初篩產(chǎn)ESBLs103株(46.19％)，確證實驗產(chǎn)ESBLs85株(38.12％)。60株耐CIP菌株中產(chǎn)ESBL42株(70％)。菌株來源以院內(nèi)感染為主，ICU及內(nèi)外科重癥病人多見，夏天易感。藥敏除了美洛培南、伊米配能、頭孢西丁、頭孢泊姆、丁胺卡那霉素較敏感以外，對大多數(shù)臨床常用的抗菌素均表現(xiàn)較高的耐藥性，而且多表現(xiàn)為多重耐藥，對

6、2種以上抗菌素同時耐藥菌株達53.81％，對6種均敏感的只占29.15％，有3株對伊米配能也耐藥。顯示廣州地區(qū)克雷伯菌耐藥情況嚴峻。肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBL株已達38.12％，其中CIP耐藥株產(chǎn)ESBL達到70％?？梢姺窝卓死撞饕菍Ζ?內(nèi)酰胺類抗生素和氟喹諾酮類耐藥，碳青霉烯類耐藥性最低，頭孢第4代、哌拉西林/他唑巴坦和丁胺卡那霉素等仍有較好的活性。為減少ESBL和多重耐菌株的產(chǎn)生，應注意謹慎合理的使用第三代頭孢菌素及其他廣譜抗菌藥

7、物。 2.質(zhì)粒介導的克雷伯桿菌耐氟喹諾酮類藥物機理研究 本實驗臨床分離株為2001年4月至2001年9月間，廣東省(廣州、深圳、中山)、湖南省(長沙、衡陽)及中山大學附屬第三醫(yī)院臨床分離株，及于2004年1月至12月在中山大學附一院收集的克雷伯菌株共200株。通過煮沸法制備模板，PCR方法篩查qnrA。并進行質(zhì)粒結(jié)合試驗。檢測ESBLs。qnrA陽性菌株進行靶酶(GyrA、GyrB、ParC、ParE)基因測定。PCR產(chǎn)

8、物送基因公司測序。探針雜交技術對qnrA進行質(zhì)粒定位。 結(jié)果篩查到攜帶qnrA的菌株2株，一株為肺炎克雷伯，另一株為產(chǎn)酸克雷伯，兩株同時產(chǎn)ESBL均陽性。它們均對環(huán)丙沙星(CIP)中度敏感。進一步的確證實驗和測序都證實含qnrA基因。 兩株菌質(zhì)粒結(jié)合實驗后在選擇平板上都有菌生長，而且其對環(huán)丙沙星MIC均有30倍以上的的提高，但定位實驗尚未完成.本實驗中亦發(fā)現(xiàn)有靶酶的改變，與前輩們的研究結(jié)果一致。 本研究中qnrA

9、的檢出率：kox1/6(16.67％)，Kpn1/194(0.5％)。和歐美等其它地方有差異，但表明在中國南方，也出現(xiàn)了質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥。qnrA的存在對臨床細菌的喹諾酮耐藥性有重要意義，也提示質(zhì)粒介導的qnrA基因存在著跨種屬廣泛傳遞、導致耐藥性播散的可能，臨床醫(yī)學工作者應予以高度重視，并采取積極措施進行預防和控制。 3.產(chǎn)氣腸桿菌耐藥研究 產(chǎn)氣腸桿菌和肺炎克雷伯菌均是腸桿菌屬細菌中一種比較常見的革蘭氏陰性菌，也是

10、醫(yī)院內(nèi)特別是重癥監(jiān)護病房導致嚴重感染的條件致病菌，亦有報道認為產(chǎn)氣腸桿菌已經(jīng)成為僅次于金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌之后革蘭氏陰性桿菌所至院內(nèi)呼吸道感染的第三大菌。因為其耐藥性的嚴重造成的治療困難已經(jīng)引起臨床醫(yī)生的高度重視，歐洲特別法國對此菌研究教多。本研究在細菌篩查過程中發(fā)現(xiàn)一株多重耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌攜帶qnrA基因，對其做了進一步研究。 用濃度梯度法(E-test法)做MIC；檢測ESBLs；質(zhì)粒結(jié)合試驗；PCR擴增qnrA。

11、 結(jié)果菌株對臨床常見的多種抗菌藥物耐藥，產(chǎn)ESBL陽性。攜帶qnrA基因，基因序列已經(jīng)提交Genebank收錄。并且結(jié)果證實此基因可以在菌株間轉(zhuǎn)移，而且可以引起MIC幾十倍的增長qnrA基因只介導低水平喹諾酮耐藥，雖然它可以擴大靶酶GyrA\PartC突變和膜通透性改變、外排泵導致的耐藥性，是一個不容忽視的問題，應該引起臨床醫(yī)生足夠重視。 小結(jié) 1.廣州地區(qū)克雷伯菌耐藥嚴重，大多表現(xiàn)為多重耐藥，同時對2種及以上抗菌

12、藥物耐藥率達53.81％。肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBL株達38.12％。選取的CIP耐藥株產(chǎn)ESBLs株為70％。 2.本研究中qnrA的檢出率：kox1/6(16.67％)，Kpn1/194(0.5％)。表明在中國南方，也存在質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥。質(zhì)粒結(jié)合實驗證實qnrA的移動對臨床細菌的喹諾酮耐藥有重要意義，也提示質(zhì)粒介導的qnrA基因存在著跨種屬廣泛傳遞、導致耐藥性播散的可能。國內(nèi)尚未見此類報道。 3.本研究在細菌篩查過