Slug對(duì)肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性及VM形成影響的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)是一種特殊的供養(yǎng)模式，它的管壁是由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的。VM與腫瘤的臨床分期、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、患者生存期的縮短有關(guān)。Slug是重要的EMT調(diào)控因子，它不僅能誘導(dǎo)EMT的發(fā)生還能夠影響腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性。腫瘤干細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤血管生成，同時(shí)它還具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力。然而，到目前為止在HCC中EMT、CSCs和VM三者之間的關(guān)系還不是很明確。本研究通

2、過對(duì)113例隨訪資料完整的人類肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)臨床病例資料進(jìn)行分析，研究Slug和E-cadherin、vimentin、VE-cadherin、VEGF、CD90和CD133等之間的關(guān)系，分析Slug對(duì)HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后生存、腫瘤干細(xì)胞表型表達(dá)的影響以及其在腫瘤血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)中的作用。利用裸鼠模型和HCC細(xì)胞系在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)臨

3、床病例資料的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。期待能為HCC的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 [研究方法]
　　 1、收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院和附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除標(biāo)本隨訪資料完整并經(jīng)病理診斷為肝細(xì)胞肝癌的病例113例，分為Slug陽(yáng)性組與Slug陰性組，分析Slug與年齡、性別、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，臨床分期之間的關(guān)系;運(yùn)用Kaplan-Meier生存分析比較兩組患者的生存預(yù)后情況。
　　 2、篩選出低表達(dá)和高表達(dá)Slug的HCC細(xì)胞系，構(gòu)建Sl

4、ug表達(dá)質(zhì)粒和shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得Slug上調(diào)和下調(diào)模型，用Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效果。利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Slug對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;進(jìn)一步利用三維培養(yǎng)模型分析Slug在腫瘤細(xì)胞血管生成過程中的作用;利用染色質(zhì)免疫共沉淀和基因芯片分析Slug的調(diào)控作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 3、利用5周齡的雄性BALB/c裸鼠建立動(dòng)物模型。分為Slug陽(yáng)性組和Slug陰性組，在每只裸鼠腋下分別注入5X1

5、06個(gè)HepG2-Slug和HepG2腫瘤細(xì)胞。每周測(cè)量裸鼠腫瘤的大小并計(jì)算腫瘤的體積，成瘤一個(gè)月后處死裸鼠。腫瘤體積計(jì)算用公式為TV=1/2×a×b2（a為腫瘤的長(zhǎng)，b為腫瘤的寬）。分析Slug在VM的形成和調(diào)節(jié)E-cadherin、vimentin、VE-cadherin、VEGF、CD90和CD133等蛋白表達(dá)水平中的作用。
　　 [結(jié)果]
　　 1、Slug的表達(dá)與VM的形成相關(guān)
　　 VM是由腫瘤細(xì)胞模

6、仿血管壁的結(jié)構(gòu)形成的可輸送血液的管道系統(tǒng)，CD31/PAS雙染可以觀察到腫瘤細(xì)胞CD31表達(dá)陰性，一層厚薄不一的PAS陽(yáng)性物質(zhì)圍繞在該管道的結(jié)構(gòu)外周形成類似基底膜樣的結(jié)構(gòu)，管道中央有紅細(xì)胞的存在。113例HCC臨床病例樣本，發(fā)現(xiàn)20例(20/113，17.7％)具有典型的VM結(jié)構(gòu)。尋找熱點(diǎn)區(qū)域，然后在高倍鏡(200x)計(jì)數(shù)VM的個(gè)數(shù)，計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值。Slug陽(yáng)性組VM計(jì)數(shù)（4.20±0.80）大于Slug陰性組VM計(jì)數(shù)（0.18±

7、0.12），兩組VM計(jì)數(shù)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.662，p=0.000)。提示在肝癌病例中Slug表達(dá)與VM的形成相關(guān)。
　　 Slug陽(yáng)性細(xì)胞可以參與形成血管生成擬態(tài)或與內(nèi)皮細(xì)胞共同形成馬賽克血管，它與腫瘤血管的形成密切相關(guān)。Hepatocyte免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示形成VM的細(xì)胞為HCC腫瘤細(xì)胞，而且Hepatocyte陽(yáng)性細(xì)胞和Hepatocyte/Slug陽(yáng)性細(xì)胞參與了腫瘤VM的形成。
　　 VE-c

8、adherin是公認(rèn)的VM形成的標(biāo)志性分子。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在113例HCC臨床病例資料中，VE-cadherin表達(dá)的陽(yáng)性率為42.5％(48/113)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，Slug的表達(dá)與VE-cadherin的表達(dá)具有相關(guān)性。VEGF表達(dá)的陽(yáng)性率為61.1％(69/113)。Slug陽(yáng)性組VEGF的表達(dá)明顯強(qiáng)于Slug陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)分析表明Slug的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 2、Slug

9、的表達(dá)與HCC的轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后相關(guān)
　　 臨床病理資料分析結(jié)果顯示，slug陽(yáng)性病例（39例）與Slug陰性病例(74例)相比Slug的表達(dá)與年齡、性別、臨床分期、病理分級(jí)等無關(guān)，與轉(zhuǎn)移有關(guān)。113例HCC臨床病例資料中轉(zhuǎn)移組為47例，非轉(zhuǎn)移組為66例。轉(zhuǎn)移組Slug陽(yáng)性率(22/47，46.8％)高于非轉(zhuǎn)移組Slug陽(yáng)性率(17/66，25.8％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=5.382，p=0.020)。Kaplan-Meie

10、r生存分析結(jié)果表明在HCC中表達(dá)Slug的患者生存期短、預(yù)后差，Slug陽(yáng)性組病人的平均生存時(shí)間34.311（95％置信區(qū)間:27.084-41.538）較Slug陰性組病人的平均生存時(shí)間44.721個(gè)月（95％置信區(qū)間:38.192-51.251）短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.025)。
　　 3、Slug能夠誘導(dǎo)EMT的發(fā)生
　　 Slug是公認(rèn)的EMT誘導(dǎo)因子，它可以抑制E-cadherin的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)E

11、-cadherin和vimentin的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示Slug的表達(dá)與E-cadherin和vimentin的表達(dá)密切相關(guān)。Slug能夠抑制E-cadherin的表達(dá)并促進(jìn)vimentin的表達(dá)。免疫組織化學(xué)雙重染色結(jié)果顯示Slug陽(yáng)性細(xì)胞其E-cadherin的表達(dá)缺失，而Slug陰性細(xì)胞的細(xì)胞膜則有E-cadherin的表達(dá)。
　　 4、Slug的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的干性特征相關(guān)
　　 CD133和CD90是

12、HCC腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，Slug的表達(dá)與CD90的表達(dá)相關(guān)(r=0.207，P=0.028)。高表達(dá)Slug的患者也高表達(dá)CD90(30.8％，12/39)，然而低表達(dá)Slug的患者只有1.4％(10/74)的患者CD90陽(yáng)性。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，Slug的表達(dá)和CSCs表面標(biāo)記分子CD90的表達(dá)密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)雙重染色結(jié)果顯示CD90陽(yáng)性細(xì)胞為HCC腫瘤細(xì)胞，而且CD90和hepatocyte雙陽(yáng)性的HCC細(xì)胞參

13、與了VM的形成。在HCC細(xì)胞中，Slug可以和CD90、CD133共表達(dá)于同一個(gè)腫瘤細(xì)胞，CD133和CD90陽(yáng)性細(xì)胞直接參與了VM的形成。提示表達(dá)CSCs表面標(biāo)記物CD133/CD90的HCC腫瘤細(xì)胞可以形成VM。
　　 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)多潛能腫瘤干細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)錄因子sox2，nanog，oct-4的表達(dá)情況。陽(yáng)性細(xì)胞均為核著色。113例HCC臨床病例資料分析結(jié)果顯示，SOX2的陽(yáng)性率為29.2％，Nanog的陽(yáng)性率為

14、13.3％，HCC幾乎不表達(dá)OCT4。Slug的表達(dá)和SOX2的表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.230，P=0.014)，slug的表達(dá)同樣和nanog的表達(dá)密切相關(guān)(r=0.210，P=0.026)。研究發(fā)現(xiàn)SOX2陽(yáng)性細(xì)胞參與了血管的形成。免疫組織化學(xué)雙重染色結(jié)果顯示，Slug可以和SOX2共表達(dá)于同一個(gè)腫瘤細(xì)胞，而且Slug和SOX2共表達(dá)的腫瘤細(xì)胞參與了VM的形成。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得到了驗(yàn)證。
　　 [結(jié)論]<

15、br>　　 1、人HCC中存在VM，VM是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的一種獨(dú)特的血液供應(yīng)模式，與內(nèi)皮依賴性血管并存于腫瘤組織內(nèi)，且VM結(jié)構(gòu)主要存在于分化差、惡性度高的實(shí)體型及低分化型的HCC中，提示這種結(jié)構(gòu)與HCC惡性生物學(xué)行為相關(guān)。
　　 2、EMT調(diào)控因子Slug與人HCC腫瘤的轉(zhuǎn)移及VM的形成正相關(guān)，與年齡、性別、臨床分期、病理分級(jí)等無關(guān)。它能夠影響病人的生存預(yù)后。Slug表達(dá)陽(yáng)性的病人生存時(shí)間短、預(yù)后差。