高爾基體磷酸蛋白2單克隆抗體制備及初步應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肝癌是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，而其中約一半患者來(lái)自于中國(guó)，已成為我國(guó)人民生命健康的一大殺手。在臨床診療中，由于肝癌早期診斷標(biāo)志物不理想等原因，導(dǎo)致患者在發(fā)現(xiàn)肝癌時(shí)往往已經(jīng)處于疾病晚期，嚴(yán)重影響了后續(xù)治療效果。最新研究初步證實(shí)高爾基體膜蛋白Ⅱ(Golph2)具有肝癌早期標(biāo)志物的特征，有望成為取代AFP的新一代肝癌標(biāo)志物。本課題組前期已制備了抗Gol

2、ph2多克隆抗體，經(jīng)證實(shí)多克隆抗體能夠特異性識(shí)別肝癌患者血清Golph2蛋白，本課題在此基礎(chǔ)上制備抗Golph2單克隆抗體并建立一種能夠快速有效檢測(cè)血清中Golph2含量的方法——雙抗體夾心ELISA法，為臨床上提供早期診斷肝癌的方法奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　構(gòu)建Golph2原核表達(dá)體系并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用His標(biāo)簽純化試劑盒純化可溶性的融合蛋白TRX-Golph2，并用純化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜

3、交瘤技術(shù)制備抗Golph2的單克隆抗體并采用腹腔注射法大量制備抗Golph2單克隆抗體腹水，用Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析單克隆抗體的特異性和相對(duì)親和力。Sepharcryl S-300 HR柱層析純化單克隆抗體并用改良的過(guò)碘酸鈉氧化法標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP），通過(guò)棋盤滴定法優(yōu)化建立雙抗體夾心ELISA，并應(yīng)用該方法檢測(cè)肝癌患者血清中Golph2的含量。
　　結(jié)果:
　　1.

4、將pET21a(+)-TRX-Golph2融合基因轉(zhuǎn)入RosettaTM菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)改變誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間最終發(fā)現(xiàn)在30℃、IPTG濃度為1.0mM，誘導(dǎo)10h時(shí)融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值，Westernblot證實(shí)為目的蛋白。最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)并裂解細(xì)菌，經(jīng)SDS-PAGE確定為可溶性表達(dá)，可溶性融合蛋白約占總?cè)诤系鞍妆磉_(dá)量的1/3。
　　2.利用融合蛋白His標(biāo)簽與Ni+親和的原理，經(jīng)親和層析成功純化了可

5、溶性的融合蛋白。
　　3.按照常規(guī)步驟免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞，克隆化后獲得5株雜交瘤細(xì)胞系，經(jīng)抗體亞型試劑盒鑒定為4株IgM，1株IgG1。腹腔注射法制備腹水，經(jīng)間接ELISA測(cè)定效價(jià)均在1∶10000以上，Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證具有較好的特異性。
　　4.Sepharcryl S-300 HR柱層析成功純化了單克隆抗體，并用改良過(guò)碘酸鈉氧化法成功標(biāo)記HRP，直接ELISA測(cè)定HR

6、P標(biāo)記的單克隆抗體工作濃度為1∶500。利用棋盤滴定法優(yōu)化了建立的雙抗體夾心ELISA體系，其中，血清稀釋度為1∶2，HRP標(biāo)記單克隆抗體最佳工作濃度為1∶500。
　　5.用已建立的雙抗體夾心ELISA法測(cè)定肝細(xì)胞癌患者和健康對(duì)照組血清Golph2含量，結(jié)果顯示，血清中Golph2含量在肝細(xì)胞癌患者血清中明顯升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功誘導(dǎo)表達(dá)了TRX-Golph2融合蛋白，并

7、在Native狀態(tài)下成功純化了融合蛋白。
　　2.成功建立了5株雜交瘤細(xì)胞系，分別命名為5B7A5，5C6D5，7F5F3，8A7B4，8C9E8。經(jīng)鑒定，其單克隆抗體均具有很高的效價(jià)及特異性。
　　3.純化并獲得了較高純度的單克隆抗體，成功用HRP標(biāo)記一株單克隆抗體，其工作濃度為1∶500。
　　4.以棋盤滴定法成功優(yōu)化建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系，此體系可以用于血清中Golph2含量測(cè)定。
　　5.經(jīng)初