白菜花粉發(fā)育和授粉受精相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的鑒定方法.pdf

1、花粉形成和授粉受精是種子植物完成有性生殖及世代交替的重要環(huán)節(jié)，與生產(chǎn)上雄性不育系的利用、種子產(chǎn)量的高低與質(zhì)量的優(yōu)劣等息息相關(guān)。揭示其分子機(jī)理對(duì)于從理論上深入理解植物基本生命現(xiàn)象以及在實(shí)踐中廣泛開(kāi)展雜交育種、提高種子產(chǎn)量和質(zhì)量等均具有重要意義。
　　近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得人們得以從基因組水平上認(rèn)識(shí)和把握以擬南芥和水稻為代表的植物生殖發(fā)育過(guò)程。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non coding RNA，lncRNA）作為

2、在基因組中廣泛存在的一類非編碼分子，已被證明是真核生物調(diào)控基因表達(dá)的重要元素，而關(guān)于其是否及在多大程度上參與了花粉發(fā)育和授粉受精等生殖發(fā)育過(guò)程，目前還鮮有報(bào)道。
　　本文在前期獲得的一條與白菜花粉發(fā)育相關(guān)的lncRNA——BcMF11的基礎(chǔ)上，試圖對(duì)其進(jìn)行表達(dá)和作用機(jī)制的進(jìn)一步研究;同時(shí)，為了篩選更多的花粉發(fā)育和授粉受精相關(guān)lncRNA，以白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis Makino，s

3、yn.Brapa ssp.chinensis）‘矮腳黃’核不育(‘Aijiaohuang' genic male sterility，ajhGMS)兩用系‘Bcajh97-01A/B’不同發(fā)育階段的花蕾及授粉后不同時(shí)間的雌蕊為材料，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)，在全基因組水平上鑒定潛在的白菜lncRNA并對(duì)獲得的lncRNA進(jìn)行了序列、在染色體上的分布、表達(dá)等特點(diǎn)的分析;在此基礎(chǔ)上，比較了不育株系（‘Bcajh97-01A

4、’）和可育株系（‘Bcajh97-01B’）Ⅰ～Ⅴ級(jí)花蕾中l(wèi)ncRNA的表達(dá)差異;分析了授粉受精過(guò)程中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況;同時(shí)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段，對(duì)獲得的白菜lncRNA進(jìn)行了是否是miRNA內(nèi)源偽靶基因的模擬以及靶基因的預(yù)測(cè)及共表達(dá)分析;對(duì)白菜lncRNA與擬南芥lncRNA的相似性進(jìn)行了比較和分析;以及根據(jù)靶基因的功能注釋進(jìn)一步挖掘了在花和花粉發(fā)育過(guò)程中起作用的候選lncRNA。取得了如下主要研究結(jié)果;
　　(1)對(duì)Bc

5、MF11基因的序列進(jìn)行了克隆，發(fā)現(xiàn)其在白菜、甘藍(lán)、黑芥的基因組中均存在多個(gè)同源相似序列;利用RT-PCR技術(shù)對(duì)其在白菜不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其并非之前研究所認(rèn)為的那樣在花蕾中特異表達(dá)，而是在根中偏向性表達(dá)。
　　(2)以ajhGMS‘Bcaj h97-01 A/B’不同發(fā)育階段的花蕾及授粉后不同時(shí)間的雌蕊為材料，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)，在構(gòu)建的Unigenes庫(kù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用生物信息學(xué)的手段，篩

6、選鑒定出了12051條高度可信的白菜候選lncRNA。利用RT-PCR方法對(duì)篩選出的部分lncRNA的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，兩者的結(jié)果基本一致。對(duì)這些白菜lncRNA的特點(diǎn)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，98％以上的白菜lncRNA長(zhǎng)度在1000 bp以內(nèi)，在白菜各染色體上均勻分布，盡管lncRNA的表達(dá)量均較低，但具有與組織及發(fā)育進(jìn)程相關(guān)的表達(dá)特點(diǎn)。
　　(3)對(duì)白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A/B’不育株系和可育株系五級(jí)花蕾（Ⅰ級(jí)花蕾對(duì)應(yīng)于

7、花粉發(fā)育的花粉母細(xì)胞時(shí)期，Ⅱ級(jí)花蕾對(duì)應(yīng)于減數(shù)分裂時(shí)期，Ⅲ級(jí)花蕾對(duì)應(yīng)于單核花粉期，Ⅳ級(jí)花蕾對(duì)應(yīng)于二核花粉期，Ⅴ級(jí)花蕾對(duì)應(yīng)于成熟花粉期）中l(wèi)ncRNA的表達(dá)分析及同級(jí)花蕾表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，在不育株系‘Bcajh97-01A’的花蕾發(fā)育過(guò)程中，Ⅳ級(jí)花蕾lncRNA的表達(dá)最多，而在Ⅴ級(jí)花蕾中特異表達(dá)的lncRNA最多;在可育株系‘Bcajh97-01B’的花蕾發(fā)育過(guò)程中，在Ⅲ級(jí)花蕾中表達(dá)的lncRNA最多，而在Ⅴ級(jí)花蕾中特異表達(dá)的lncRNA最

8、多。綜合五級(jí)花蕾的lncRNA表達(dá)情況，在可育株系花蕾中表達(dá)的lncRNA的總數(shù)比在不育株系花蕾中表達(dá)的lncRNA總數(shù)要高;在同級(jí)花蕾中，除Ⅳ級(jí)外，其余發(fā)育階段的花蕾均表現(xiàn)出可育株系比不育株系具有更多的lncRNA的表達(dá);在可育株系和不育株系的花蕾中也具有共同表達(dá)的lncRNA，其中，Ⅰ級(jí)花蕾具有最多的共表達(dá)lncRNA，共表達(dá)最少的是Ⅳ級(jí)花蕾。
　　(4)對(duì)白菜授粉后不同時(shí)間的雌蕊（授粉后1h為花粉在柱頭的萌發(fā)階段，授粉后3h

9、為花粉管在花柱道中的生長(zhǎng)階段，授粉后10h為花粉管到達(dá)胚珠并受精階段）表達(dá)的lncRNA進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，授粉后3h，雌蕊中l(wèi)ncRNA的表達(dá)最多;與未授粉對(duì)照相比，授粉后1h時(shí)部分lncRNA的表達(dá)受抑制，表達(dá)數(shù)目反而減少。
　　(5)對(duì)白菜從花蕾到授粉受精整個(gè)發(fā)育過(guò)程中l(wèi)ncRNA的持續(xù)表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，從花蕾形成開(kāi)始到授粉后10h期間，其中約1/10的lncRNA持續(xù)表達(dá)，其余大部分為階段性特異表達(dá)。
　　(6)利用生物信

10、息學(xué)手段，以本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的、同樣在ajhGMS‘ Bcajh97-01A/B’花蕾中表達(dá)的miRNA為目標(biāo)，對(duì)獲得的白菜lncRNA進(jìn)行了是否為這些miRNA的內(nèi)源偽靶基因的預(yù)測(cè)，得到15個(gè)可能作為miRNA內(nèi)源偽靶基因的lncRNA。
　　(7)對(duì)白菜lncRNA的Trans類靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及其共表達(dá)分析，得到904個(gè)lncRNA的共6236個(gè)Trans類靶基因，其中144個(gè)lncRNA與706個(gè)靶基因存在共表達(dá)關(guān)系。