內(nèi)皮抑素對ACHN RCC中缺氧誘導因子和血管內(nèi)皮生長因子表達的影響.pdf

1、目的：利用已構建的帶有內(nèi)皮抑素基因真核表達載體質(zhì)粒導入裸鼠ACHN RCC中，研究內(nèi)皮抑素基因對缺氧誘導因子和血管內(nèi)皮生長因子表達的影響。
　　 方法：
　　 1.質(zhì)粒的制備將含有pSecES和pcDNA3.1 質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以堿性裂解法制備質(zhì)粒，PEG 沉淀法純化，其OD 值介于1.8-1.9，臨用前調(diào)整濃度至1ug/ul。
　　 2.腫瘤模型的制備將ACHN細胞在含10％胎牛血清

2、的MEM 培養(yǎng)基(GibcoBRL公司)中在37℃5[％]的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長到對數(shù)生長期，PBS 洗滌，并調(diào)整細胞濃度至1×10 7個/L，在裸鼠右側背部皮下注射0.2ml，總共注射24只裸鼠。
　　 于接種腫瘤細胞7天后，腫瘤體積達到60～80mm 3，此時開始實驗干預3.實驗分組和干預將荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組8只。干預組：每只裸鼠瘤內(nèi)注射復合物100ul，含30ul 梭華－Sofast tm和30ug p

3、SecES 質(zhì)粒；對照組：每只裸鼠瘤內(nèi)注射復合物100ul，含30ul 梭華－Sofast tm和30ug pcDNA3.1 質(zhì)粒；空白組：裸鼠不進行任何干預。各組每只裸鼠間隔3 天注射一次，連續(xù)注射3 次。觀察裸鼠一般情況。
　　 4.HE 染色和免疫組織化學染色于接種后第34 天斷頸處死裸鼠，解剖皮下腫瘤并稱瘤重，取腫瘤組織入4％多聚甲醛液固定，石蠟包埋，5um 切片。相鄰切片進行病理組織檢查，同時分別以兔抗鼠角蛋白-18

4、抗體，兔抗鼠缺氧誘導因子2a(HIF-2 α)抗體，兔抗鼠VEGF 抗體為一抗。按SP法進行免疫組化染色，DAB 顯色，蘇木素復染。
　　 5.結果判定每只動物腫瘤組織切片隨機選取3 張，每張切片隨機選取7個視野，采用Image-pro plus 5.0.1 系統(tǒng)進行定量分析，選取每張切片的空白處進行校正，以3 張切片的平均值作為該例腫瘤組織免疫組化陽性強度的平均積分密度。HIF表達為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒狀物，胞漿內(nèi)亦

5、有部分棕黃色顆粒表達。VEGF的特異性免疫反應產(chǎn)物分布在細胞胞漿內(nèi)，為棕黃色顆粒。
　　 結果：
　　 1.HE 染色和keratin-18 免疫組化染色均符合RCC 特征。
　　 2.干預組、對照組、空白組腫瘤組織中的HIF-2 α平均積分光密度分別為5.36±0.59，6.28±0.76，6.4±0.77。干預組腫瘤HIF-2 α表達明顯減少，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=5.124，P<0.05.
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6、.干預組、對照組、空白組腫瘤組織中的VEGF平均積分光密度分別為18.68±2.11，22.45±2.51，22.11±2.55。干預組腫瘤VEGF表達明顯減少，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=5.666，P<0.05.
　　 4.荷瘤期間裸鼠毒副作用的觀察，荷瘤期裸鼠活動良好，無腹瀉等不良反應。
　　 結論：
　　 1 .內(nèi)皮抑素基因通過持續(xù)分泌內(nèi)皮抑素抑制裸鼠ACHN RCC 腫瘤的生長，HIF-2 α、VEGF表達減