α-淀粉酶結構與功能關系研究.pdf

1、本文通過對野油菜黃單胞菌α-淀粉酶基因進行分段克隆，對其N端和C端進行截短然后在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達，通過對表達酶學性質的研究來探討其基因結構與功能之間的關系。 克隆到一個截去信號肽的產(chǎn)α-淀粉酶的重組質粒(pKSAMY2)并在大腸桿菌DH5α中表達，結果發(fā)現(xiàn)該不含信號肽的淀粉酶具有酶活。這說明不含信號肽的酶能夠正確折疊并保持其空間結構，具有其催化中心和底物結合部位。試驗中我們發(fā)現(xiàn)信號肽序列對于胞內的α-淀粉酶(KSXC2)活

2、性沒有任何影響。 為了研究C端非催化區(qū)對催化能力和特異性的影響，我們克隆了三個大小不同的截短的α-淀粉酶。重組表達載體pKSXC1、pKSXC3和pKSXC4分別轉化入大腸桿菌DH5α中，重組菌株經(jīng)0.5％可溶性淀粉誘導表達產(chǎn)物都具有酶活，經(jīng)10％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測后用凝膠成像分析軟件分析其分子量分別為14kDa，25.7kDa,35.8kDa，與從截短淀粉酶核苷酸序列推算出來的氨基酸的分子量大小一

3、致。分析截短酶活性質發(fā)現(xiàn)截短α-淀粉酶(KSXC1)的活性略高于出發(fā)α-淀粉酶的酶活，這說明截去保守區(qū)B，C，D區(qū)的酶活性中心沒有改變，也不是表達量的變化使酶活提高。據(jù)推測可能失去保守區(qū)B，C，D的影響，酶活中心與底物結合的效率和特異性發(fā)生改變。兩個截短酶(KSXC3和KSXC4)的最適溫度與出發(fā)菌株酶(KSXC)相同。然而這三種酶的熱穩(wěn)定性卻存在著比較大的差異。 生物信息學分析表明，該α-淀粉酶的具有四個保守區(qū)域，分別為保守區(qū)