布魯氏菌外膜蛋白OMP31在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控研究.pdf

1、目的:布魯氏菌(Brucella)是一種可導(dǎo)致人及多種動(dòng)物急性、慢性感染的革蘭氏陰性、兼性胞內(nèi)寄生菌。巨噬細(xì)胞是布魯氏菌生存和繁殖的靶細(xì)胞,布魯氏菌不但可寄生于巨噬細(xì)胞并可抑制其凋亡,布魯氏菌外膜蛋白OMP31在布魯氏菌的毒力及胞內(nèi)寄生中均起重要作用,因此本研究欲構(gòu)建布魯氏菌omp31基因缺失株,以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象探討布魯氏菌外膜蛋白OMP31在巨噬細(xì)胞凋亡中不同階段的作用。
　　方法:本研究用PCR方法分別擴(kuò)增omp31基因的

2、側(cè)翼序列及枯草芽孢桿菌SacB基因,利用雙酶切的方法分別將三個(gè)片段連入自殺載體pGEM-7zf+,獲得亞克隆pGEM-7zf+-?omp31-SacB。將所構(gòu)建好的自殺載體通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入布魯氏菌16M感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)兩次同源重組后篩選出16M?omp31基因缺失株,對(duì)獲得缺失株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)及細(xì)菌學(xué)性質(zhì)鑒定。分別收集2h、4h、8h、12h、24h不同時(shí)間段利用親本株及缺失株侵染的小鼠巨噬細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其不同時(shí)間段早期凋亡

3、率;采用雙抗體夾心ELISA的方法測(cè)定小鼠巨噬細(xì)胞不同時(shí)間段釋放CytC以及細(xì)胞因子TNF-α的情況;通過QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間段TNF-α、Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:(1)成功獲得16MΔomp31基因缺失株,在15代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)性突變說明缺失株具有遺傳穩(wěn)定性,細(xì)菌學(xué)性質(zhì)鑒定表明其為布魯氏菌羊種1型;(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明缺失株明顯促進(jìn)感染巨噬細(xì)胞早期凋亡;(3)ELISA結(jié)果表明除2h外其他

4、各時(shí)間點(diǎn)缺失株侵染的巨噬細(xì)胞釋放的Cytc均高于親本株侵染的巨噬細(xì)胞釋放的Cytc;而各時(shí)間點(diǎn)缺失株侵染的巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α均高于親本株;(4)利用QRT-PCR檢測(cè)兩者TNF-αmRNA表達(dá)量各時(shí)間點(diǎn)均處于上調(diào),BaxmRNA表達(dá)量除4h外各時(shí)間點(diǎn)均處于上調(diào),Bcl-2mRNA表達(dá)量除2h外,各時(shí)間點(diǎn)均處于下調(diào)。
　　結(jié)論:(1)成功構(gòu)建布魯氏菌16MΔomp31基因缺失株,缺失株可穩(wěn)定遺傳并未發(fā)生細(xì)菌學(xué)性質(zhì)改變;(2)布