RNAi沉默G250-MN-CAIX基因對腎癌Ketr-3細胞株生物學行為的影響.pdf

1、研究背景 腎細胞癌簡稱腎癌，是最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。對轉移性腎癌尚無標準治療方案，目前常采用IFN-a或(和)IL-2，或抗VEGF的多靶點激酶抑制劑二線藥物。但是上述藥物都是作用于全身，無靶點特異性。因此，需要尋找一種特異性治療方法成為抗腎癌治療的迫切需要。 G250／MN／CAIX是從多種RCC細胞系中鑒別和克隆出一種廣泛表達的腎細胞癌相關抗原。所有的腎透明細胞癌和大部分其它類型腎癌都表達G250抗原，8

2、8％的轉移灶也有該抗原表達。其在調節(jié)細胞內外pH方面發(fā)揮重要的作用?？赡艽龠M腫瘤細胞增生和轉移，在腎癌的演變過程中起重要的作用。 目的 1.構建針對G250的shRNA真核表達載體； 2.觀察RNAi沉默G250基因表達后，腎癌Ketr-3細胞生長速度和體外侵襲力的變化，初步了解G250在腎癌中的生物學功能，為探索腎癌的發(fā)病機理提供一定的實驗基礎及理論依據(jù)。 方法 1.根據(jù)Genbank中G250

3、基因的序列，合成shRNA序列，克隆至真核表達載體pSilencer 2.1-U6-neo中，構建G250 shRNA真核表達載體，并經(jīng)PCR、限制性雙酶切和部分DNA測序鑒定； 2.經(jīng)陽離子脂質體介導將表達載體轉染至人腎癌Ketr-3細胞株中，經(jīng)G418(400μg／ml)篩選后獲得陽性轉染細胞株，命名為Ketr-3-MNRi。RT-PCR在RNA水平和Westem blot、間接免疫熒光在蛋白水平分別對干擾效率進行檢測；

4、 3.MTT法繪制細胞生長曲線，觀察干擾后細胞生長情況的變化；Transwell侵襲小室通過過膜細胞數(shù)的差異，探討干擾因素對Ketr-3細胞的體外侵襲能力的影響。 結果 1.經(jīng)PCR、限制性雙酶切和部分DNA測序證實成功構建了G250 shRNA的真核表達載體，經(jīng)陽離子脂質體介導轉染Ketr-3細胞中，并經(jīng)G418篩選后獲得陽性克隆細胞株。 2.RT-PCR結果顯示Ketr-3-MNRi組對mRNA抑制下降6

5、4.4％。，Western blot結果顯示Ketr-3-MNRi的蛋白表達比Ketr-3-NC下降58.5％；間接免疫熒光顯示Ketr-3／MNRi細胞的綠色熒光比Kerr-3、Ketr-3／NC弱很多。 3.細胞生長曲線結果顯示Ketr-3-NC組細胞與未轉染Ketr-3細胞兩組間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。Ketr-3-MNRi組的腫瘤細胞生長與Ketr-3細胞，Ketr-3-NC組細胞相比較減慢(p<0.05)。

6、 4.細胞體外侵襲力結果顯示：Ketr-3-MNRi細胞其穿膜細胞數(shù)明顯低于陰性對照組Ketr-3-NC及Ketr-3細胞組，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。但Ketr-3-NC及Ketr-3細胞組間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 結論 1.成功構建了G250 shRNA的真核表達質粒，并經(jīng)證實對腎癌Ketr-3細胞中的G250表達具有干擾效應; 2.抑制G250表達得Ketr-3細胞生長速度及侵襲力