重組Ig結(jié)合分子噬菌體展示文庫的構(gòu)建及選擇研究.pdf

1、安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文重組Ig結(jié)合分子噬菌體展示文庫的構(gòu)建及選擇研究姓名：徐容申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：鄧松華潘衛(wèi)20040401安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要定向分子進(jìn)化是探索研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的重要手段，同時(shí)也是改造、優(yōu)化生物大分子特性的有效方法。噬菌體展示及篩選和DNA重排是體外定向分子進(jìn)化的重要核心技術(shù)。proteinA和proteinL是兩種不同的細(xì)菌表面蛋白，均可與Ig結(jié)合，但各自有不同的

2、特點(diǎn)。本研究應(yīng)用DNA重排技術(shù)將proteinA的單個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和proteinL的單個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合，構(gòu)建了重組Ig結(jié)合多肽PALn分子文庫，并采用噬菌體展示技術(shù)結(jié)合體外定向進(jìn)化lgG親和篩選，探究Ig結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，同時(shí)為定向改造Ig結(jié)合分子打下基礎(chǔ)。本研究分四個(gè)部分：一、新型噬菌體展示載體pCANTAB5S的構(gòu)建：二、噬菌體展示Ig結(jié)合多肽PLn分子文庫的構(gòu)建及篩選：三、噬菌體展示Ig結(jié)合多肽PALn分子文

3、庫的構(gòu)建及篩選；四、(MDPLMDPA)n代表分子的原核表達(dá)、純化及功能鑒定。一、新型噬菌體展示載體pCANTAB5S的構(gòu)建通過基因操作，將限制酶切位點(diǎn)SacI引入到噬菌體展示載體pCANTAB5L，并校正了pCANTAB5L載體StuI、SalI等位點(diǎn)的讀框。具體過程是：以pCANTAB5X—IFNa2b重組質(zhì)粒為模板，在上游引物中引入XbaI、SacI酶切位點(diǎn)，在下游引物中引入SacI、StuI、salI酶切位點(diǎn)，將用該引物擴(kuò)增的I

4、FNa2b銜接片段PCR產(chǎn)物克隆到pMDl8T中，再將該片段用XbaI和SalI酶切并將之插入pCANTAB5L的XbaI和SaII位點(diǎn)中，經(jīng)SacI酶切，線性載體片段自連，構(gòu)成新型噬菌體展示載體pCANTAB5S。序列分析證明pCANTAB5S在pCANTAB5L原有XbaI和StuI之間引入SacI位點(diǎn)，并校正了原StuI的讀框，有利于各種外源隨機(jī)多肽和功能蛋白的有效展示。二、噬菌體展示Ig結(jié)合多肽PLn分子文庫的構(gòu)建及篩選用含Sa

5、cI位點(diǎn)的特定引物PCR擴(kuò)增proteinL的B3抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(L)，SacI酶切后經(jīng)DNA重排連接形成各種不同長度的PLn隨機(jī)分子庫，并將該文庫呈現(xiàn)在噬菌體表面，構(gòu)建了噬菌體展示Ig結(jié)合多肽PLn文庫。所建肽庫容量為3105個(gè)菌落形成單位，滴度為6210YU／ml。通過三輪IgG親和篩選，選擇后的12個(gè)陽性克隆DNA測序分析顯示8個(gè)為2L序列，1個(gè)為L序列，證實(shí)了proteinL的單個(gè)B結(jié)構(gòu)域具有Ig結(jié)合功能，2個(gè)重復(fù)protein