miR-145在硬皮病TGF-β-Smad3促纖維化通路中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：硬皮病是一種以廣泛纖維化、血管改變和免疫異常為主要特點(diǎn)的自身免疫性疾病。硬皮病最常累及皮膚,引起膠原生成增加、細(xì)胞外基質(zhì)沉積增加。此外,還可累及肺臟、心臟、腎臟、消化道等內(nèi)臟器官,導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化、肺動(dòng)脈高壓等嚴(yán)重并發(fā)癥,10年生存率約為60％～90％。由于其病因不明,暫無(wú)特效治療方法,特別是缺乏針對(duì)進(jìn)行性纖維化的靶向治療。隨著對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的深入研究,學(xué)者們認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)生成增多是由成纖維細(xì)胞過(guò)度活化所致,在內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)

2、胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的互相作用下,通過(guò)細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等多種介質(zhì),成纖維細(xì)胞過(guò)度活化,形成惡性循環(huán)。闡明硬皮病的發(fā)病機(jī)制對(duì)于了解臨床分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后至關(guān)重要。
　　皮膚和臟器進(jìn)行性纖維化是硬皮病的主要病理生理過(guò)程,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-β是其中的重要組成部分。TGF-β是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效趨化物,能使細(xì)胞外基質(zhì)合成增多(如Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等),使成纖維細(xì)胞合

3、成纖連蛋白增多,調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)粘附蛋白受體,調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生(如纖溶酶原激活物或膠原酶原)。通過(guò)自身誘導(dǎo),TGF-β能刺激成纖維細(xì)胞合成TGF-β,上調(diào)TGF-β受體的表達(dá)。TGF-β持續(xù)生成增多,引起細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性沉積,進(jìn)而導(dǎo)致纖維化。TGF-β主要通過(guò)Smad家族轉(zhuǎn)錄激活因子實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞,其中Smad3與其關(guān)系最為密切。在活化的TGF-β刺激下,Smad3被TGF-β受體Ⅰ激酶磷酸化,繼而與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物,進(jìn)入細(xì)胞核,與Sm

4、ad結(jié)合元件及轉(zhuǎn)錄因子相互作用,誘導(dǎo)編碼細(xì)胞外基質(zhì)的基因表達(dá)升高。
　　microRNAs(miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子,與mRNA3’端非翻譯區(qū)種子序列配對(duì),主要負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。如果配對(duì)完全或接近完全,靶mRNA將被完全降解。如果配對(duì)不完全,則與靶mRNA形成復(fù)合物,抑制mRNA的翻譯。最近數(shù)年間發(fā)現(xiàn)的miRNA呈指數(shù)增長(zhǎng),由人類(lèi)基因組編碼的miRNA目前已超過(guò)千種。miRNA與多種自身免疫

5、性疾病的發(fā)病相關(guān),如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征和原發(fā)性膽汁性肝硬化。最新研究發(fā)現(xiàn),miRNA可能參與硬皮病發(fā)病機(jī)制,但其具體定位及其靶基因有待進(jìn)一步探討。
　　miRNA芯片技術(shù)是一種高通量miRNA篩查方法,可檢測(cè)患者與正常對(duì)照中miRNA的差異表達(dá)。本研究擬采用miRNA芯片技術(shù),篩選在硬皮病患者和正常人中差異表達(dá)的miRNAs,并通過(guò)生物信息學(xué)分析,尋找出與TGF-β/Smad促纖維化信號(hào)通路相關(guān)的miRNA,

6、并采用real-time PCR、免疫組化等試驗(yàn)方法,從組織、細(xì)胞水平驗(yàn)證目標(biāo)miRNA及其靶基因在硬皮病發(fā)病中的作用。開(kāi)展本研究,有望為闡明miRNA在硬皮病發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為研發(fā)特異性抗纖維化靶向治療提供目標(biāo)miRNA。
　　第一部分 miRNA在硬皮病患者皮膚中的差異表達(dá)
　　目的：通過(guò)比較硬皮病患者與正常對(duì)照的miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)在硬皮病患者中具有差異表達(dá)的miRNAs。
　　方法：采集7例硬

7、皮病患者與7例對(duì)照者的臨床資料和皮膚樣本,進(jìn)行組織病理檢查,并采用miRNA芯片技術(shù)分析具有差異表達(dá)的miRNAs。
　　結(jié)果：在7例硬皮病患者中,5例為彌漫性硬皮病,2例為局限性硬皮病,男性2例,女性5例,年齡為30～64歲,平均年齡49.0歲,平均病程16.6個(gè)月。對(duì)照組7例,其中男性4例,女性3例,年齡為21～58歲,平均年齡44.8歲。從硬皮病患者與對(duì)照者前臂取皮膚樣本,分別進(jìn)行病理檢查、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)和miRNA芯片分析

8、。硬皮病患者的皮膚病理檢查顯示膠原過(guò)度沉積和深部纖維化。經(jīng)miRNA芯片技術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)在彌漫性硬皮病患者中,表達(dá)差異的miRNAs共有42個(gè),其中25個(gè)表達(dá)上調(diào),17個(gè)表達(dá)下降。在局限性硬皮病患者中,表達(dá)差異的miRNAs共有60個(gè),其中42個(gè)表達(dá)上調(diào),18個(gè)表達(dá)下降。21個(gè)miRNAs在彌漫性硬皮病和局限性硬皮病中均有表達(dá)差異,其中13個(gè)上調(diào),8個(gè)下調(diào)。
　　結(jié)論：硬皮病患者與正常對(duì)照的皮膚組織具有不同的miRNAs表達(dá)譜。

9、r>　　第二部分 miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及機(jī)制研究
　　目的：探討miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及其機(jī)制。
　　方法：通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選與TGF-β/Smad3通路相關(guān)的miRNA。采用real-time PCR檢測(cè)miR-145在硬皮病患者和正常對(duì)照者的皮膚組織和皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá),免疫組化、real-time PCR檢測(cè)Smad3蛋白和mRNA在硬皮病患

10、者和正常對(duì)照者的皮膚組織和皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá),real-time PCR檢測(cè)TGF-β刺激時(shí)硬皮病患者和正常對(duì)照者的皮膚成纖維細(xì)胞中miR-145和Smad3 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA中含有miR-145結(jié)合的種子序列。對(duì)正常對(duì)照相比,miR-145在硬皮病患者的皮膚組織和皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)均顯著降低(P＜0.05),Smad3 mRNA在硬皮病皮膚組織和皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)顯