雌激素受體β在人牙周膜成纖維細胞成骨分化中作用的研究.pdf

1、骨密度降低與骨質(zhì)疏松是骨代謝增齡改變的結(jié)果，是中老年骨骼生理的主要特征。絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)展迅速，與機體雌激素缺乏有關(guān)。研究表明雌激素在骨吸收與改建中發(fā)揮了極其重要的作用。牙槽骨是機體骨質(zhì)密度較低的骨組織，最容易發(fā)生骨質(zhì)疏松，主要表現(xiàn)為牙槽骨吸收，導致牙齒松動與脫落，直接影響患者牙齒和牙周組織健康與口腔治療，但至今對牙槽骨吸收與改建的機理并不十分明確。
　　人牙周膜成纖維細胞（Humanperiodontalligamentfi

2、broblast，HPLF）是牙周組織中重要的細胞成分，通過增殖、分化、分泌基質(zhì)參與到牙周組織的改建中，研究表明雌激素能夠促進牙周膜成纖維細胞向成骨分化，增加其成骨活力，對于維持牙周組織正常的改建和損傷后的修復有重要的意義。雌激素的生物學作用主要是通過細胞內(nèi)雌激素受體（Estrogenreceptor，ER）介導的，研究證實牙周膜成纖維細胞有ER基因的表達，但雌激素受體在牙周膜成纖維細胞成骨分化中所起的作用及其機理尚不清楚。因此，為了探

3、討雌激素受體在牙周膜成纖維細胞成骨分化中的作用，以期進一步探明雌激素受體在牙槽骨吸收與改建中的作用以及骨質(zhì)疏松牙槽骨吸收的機理，進而為減緩牙槽骨吸收、維護牙齒穩(wěn)固性開辟新的途徑，我們設(shè)計并進行了如下實驗：
　　1、雌激素受體在人牙周膜成纖維細胞中的表達
　　取因正畸原因拔除的第一前磨牙牙周膜組織，用組織塊結(jié)合酶消化法培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞，采用RT-PCR法檢測ERα和ERβmRNA的表達，Westernblot法分析ERα

4、和ERβ蛋白的表達。
　　2、ERβ基因siRNA表達載體的構(gòu)建及其在人牙周膜成纖維細胞中的表達
　　依據(jù)siRNA設(shè)計原則，結(jié)合ERβ基因的序列特征，設(shè)計合成靶向ERβ的siRNA，將其插入pSilencer3.1-H1-neo載體，構(gòu)建ERβ基因的siRNA真核表達載體，并對其進行鑒定。應用脂質(zhì)體法將干涉載體瞬時轉(zhuǎn)染HPLF細胞，應用RT-PCR、Westernblot法初步鑒定瞬時轉(zhuǎn)染前后HPLF細胞中ERβ基因及蛋白

5、表達水平有無變化。經(jīng)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，應用RT-PCR、Westernblot法分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA真核表達載體前后HPLF細胞中ERβmRNA和蛋白水平的變化。
　　3、雌激素受體β對人牙周膜成纖維細胞成骨分化能力的影響
　　以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF（HPLF-siERβ1和HPLF-siERβ2）和未轉(zhuǎn)染的HPLF為研究對象，在雌激素刺激下，檢測細胞堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase

6、，ALP）活性和骨鈣素（Osteocalcin，OCN）含量，研究雌激素及雌激素受體對HPLF細胞成骨分化能力的影響。
　　4、雌激素受體β對人牙周膜成纖維細胞OPG和RANKL表達的影響
　　以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF（HPLF-siERβ1和HPLF-siERβ2）和未轉(zhuǎn)染的HPLF為研究對象，雌激素干預后，RT-PCR、Westernblot分別檢測OPG、RANKLmRNA和蛋白的表達，研究雌激素對HPLF細胞OPG和RA

7、NKL表達的影響，以及ERβ基因干涉后，細胞OPG和RANKL表達的變化情況。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　1、ERα、ERβmRNA和蛋白在HPLF細胞中均有表達，而且ERβ的表達明顯高于ERα。
　　2、通過測序驗證，成功構(gòu)建了ERβ基因siRNA真核表達載體。RT-PCR和Westernblot法檢測分別表明瞬時轉(zhuǎn)染的HPLF中ERβ基因的表達、蛋白含量均受到明顯抑制。經(jīng)過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF細胞，RT-P

8、CR、Westernblot檢測結(jié)果再次表明，siRNA明顯抑制了HPLF細胞中ERβ基因的表達。
　　3、雌激素對細胞干預后，未轉(zhuǎn)染的HPLF細胞ALP活性和OCN含量明顯增強，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF細胞ALP活性和OCN含量沒有明顯改變。
　　4、雌激素干預細胞后，未轉(zhuǎn)染的HPLF細胞中OPGmRNA和蛋白的表達顯著增強，RANKLmRNA和蛋白的表達顯著減少，但穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HPLF細胞中OPG和RANKLmRNA和蛋白的表

9、達沒有明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1、體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞中可觀察到ER兩種亞型的表達。RT-PCR和Westernblot法分別從mRNA水平和蛋白水平證實了ERα、ERβ在HPLF上均有表達，且ERβ的表達明顯強于ERα，提示雌激素在HPLF細胞的增殖、分化中發(fā)揮作用是通過配體-受體途徑實現(xiàn)的，而且可能主要是以ERβ為主介導的。
　　2、ERβsiRNA表達載體能夠有效抑制HPLF細胞中ERβmRNA和蛋白

10、水平的表達。
　　3、雌激素明顯增加了未轉(zhuǎn)染的HPLF細胞ALP活性和OCN的含量，但對ERβ基因干涉的HPLF細胞ALP和OCN的表達沒有明顯影響。說明雌激素可能主要是通過ERβ亞基促進牙周膜成纖維細胞向成骨方向分化，增強了牙周膜成纖維細胞的成骨活力。
　　4、HPLF細胞在雌激素作用下，其OPG的表達顯著提高，RANKL表達明顯減少，但HPLF細胞經(jīng)ERβsiRNA轉(zhuǎn)染封閉ERβ亞基后，雌激素對OPG和RANKL表達水平