PRRSV調(diào)控NF-κB信號通路的機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，困擾全球養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。PRRS病毒(PRRSV)感染豬后導(dǎo)致炎癥調(diào)節(jié)失衡，一方面在感染早期炎癥因子的表達(dá)被抑制，另一方面在感染晚期炎癥因子大量表達(dá)，形成“炎癥因子”風(fēng)暴，這也是PRRSV導(dǎo)致感染豬死亡的重要因素之一。
　　炎癥反應(yīng)是十分復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，涉及模式識別受體(PRRs)、接頭蛋白、激酶、轉(zhuǎn)錄因子、促炎細(xì)胞因子等，同時還涉及各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如

2、泛素化和磷酸化。其中炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在炎癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著非常重要的作用。目前，識別PRRSV的模式識別受體及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)節(jié)尚未明確，PRRSV抑制早期炎癥反應(yīng)的作用靶點(diǎn)和具體機(jī)制也不清楚。本文首先分析了Nucleotide-binding oligomerization domains(NOD)-like receptors(NLRs)和DExD/H-box helicase兩類模式識別受體在PRRSV感染晚期激活NF

3、-κB中的作用，隨后篩選了抑制NF-κB激活的PRRSV編碼蛋白并探討了其作用機(jī)制。從模式識別受體、接頭蛋白和線性泛素化修飾等層面，初步揭示了PRRSV調(diào)控炎癥相關(guān)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.PRRSV通過NOD2激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制
　　通過real-time RT-PCR檢測PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后，部分NLRs家族蛋白mRNA的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)NOD1、NOD2和NLR

4、P3的表達(dá)上調(diào)達(dá)到5倍左右。Western blot實驗發(fā)現(xiàn)在蛋白水平上，PRRSV感染上調(diào)NOD2和NOD2通路接頭蛋白receptor-interacting protein2(RIP2)表達(dá)。陽性刺激物muramyl dipeptide(MDP)能夠激活RIP2磷酸化，而不能上調(diào)RIP2表達(dá)。而PRRSV感染不僅上調(diào)RIP2表達(dá)，也能誘導(dǎo)RIP2磷酸化。進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)NOD2或RIP2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MDP和PRRSV誘

5、導(dǎo)的NF-κB啟動子激活，P65磷酸化以及MAPK通路的P38，JNK和ERK磷酸化水平均受不同程度的抑制，PRRSV誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES的表達(dá)量也顯著下調(diào)。上述研究結(jié)果表明PRRSV可以通過NOD2激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　2.DHX36識別N蛋白，激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制
　　DExD/H helicases是一類高度保守的ATP依賴的解旋酶，研究表明該家族的部分成員，如DH

6、X36，能夠識別病毒，激活天然免疫。為了研究DHX36在PRRSV感染中的作用，首先通過Western blot檢測PRRSV感染細(xì)胞后DHX36的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DHX36的表達(dá)量在PRRSV感染24h以后顯著上調(diào)。間接免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)在未感染PRRSV時，大部分DHX36在細(xì)胞漿和細(xì)胞核彌散分布，但PRRSV導(dǎo)致DHX36從細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)，呈明顯的細(xì)胞漿分布。通過NF-κB啟動子雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，干擾DHX36表達(dá)后，PRRSV誘導(dǎo)

7、的NF-κB啟動子激活，IκB降解和P65磷酸化以及IL-6， IL-8，TNF-α和RANTES等炎癥因子的mRNA表達(dá)水平均受到明顯抑制。上述研究結(jié)果表明DHX36在PRRSV誘導(dǎo)NF-κB激活中扮演重要作用。
　　前期研究表明PRRSV編碼的核衣殼蛋白(N)能激活NF-κB，但其作用機(jī)制不清楚。通過雙熒光素酶實驗，發(fā)現(xiàn)干擾內(nèi)源性的DHX36之后，N蛋白誘導(dǎo)NF-κB激活被顯著抑制，而超表達(dá)DHX36顯著促進(jìn)N蛋白誘導(dǎo)的NF-

8、κB激活，表明DHX36參與N蛋白誘導(dǎo)的NF-κB激活。免疫共沉淀(Co-IP)實驗進(jìn)一步顯示DHX36和N蛋白存在相互作用。
　　3.PRRSV nsp1α蛋白通過靶向LUBAC抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制
　　linear ubiquitin chain assembly complex(LUBAC)由催化亞基HOIP和結(jié)合亞基HOIL-1L及SHARPIN組成。其介導(dǎo)的NEMO分子線性泛素化修飾是NF-κB激活所必須的

9、。首先通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染后10-20h抑制LUBAC超表達(dá)誘導(dǎo)的NF-κB啟動子活性。LUBAC超表達(dá)能夠顯著誘導(dǎo)IκB降解和P65磷酸化，而PRRSV感染后，IκB降解和P65磷酸化受到明顯抑制。進(jìn)一步通過雙熒光素酶篩選發(fā)現(xiàn)nsp1α能夠抑制LUBAC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。構(gòu)建了nsp1α結(jié)構(gòu)域缺失突變體，結(jié)果顯示超表達(dá)nsp1α△N能夠抑制LUBAC，而nsp1α△C失去抑制功能。Co-IP實驗顯示nsp1α與LUBAC