microRNA在肝細(xì)胞中的天然免疫功能研究.pdf

1、目的：
　　 微小RNA(microRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的小分子非蛋白編碼的RNA家族，主要功能是通過(guò)與靶基因mRNA3’非編碼區(qū)不完全的互補(bǔ)結(jié)合而導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，廣泛地參與生物體內(nèi)與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展的眾多生物學(xué)過(guò)程。
　　 越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-155(miR-155)參與多種生命活動(dòng)，包括免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等。在巨噬細(xì)胞中

2、，miR-155可以受到聚肌胞苷酸(polyI:C)等多種Ton樣受體(TLR)配體以及Ⅰ型干擾素和一些細(xì)胞因子刺激而表達(dá)升高，這些預(yù)示著miR-155在細(xì)菌和病毒的免疫應(yīng)答中應(yīng)該發(fā)揮著一定的作用。此外，在EB病毒感染的B細(xì)胞中，miR-155可以受到LMP1誘導(dǎo)表達(dá)升高，并通過(guò)靶向PU.1andIKKε負(fù)調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路而維持潛伏期EB病毒的穩(wěn)定性，而在水皰性口炎病毒感染的巨噬細(xì)胞中，miR-155又可以增強(qiáng)Ⅰ型干擾素信

3、號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)于病毒的清除。
　　 乙肝病毒是一種嗜肝DNA病毒，其感染可導(dǎo)致人類(lèi)急性和慢性肝炎，急性肝炎中大約有0.5％會(huì)死于致命的爆發(fā)性肝炎，在成人感染中約有5％發(fā)展成慢性肝炎，進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化或原發(fā)性肝癌。相比HCV與肝細(xì)胞miRNA的研究，miRNA影響HBV存在性的研究要滯后得多。直到近期，才陸續(xù)出現(xiàn)一些研究表明，miRNA的確在HBV感染肝細(xì)胞的復(fù)雜過(guò)程中發(fā)揮作用。鑒于此，我們?cè)诟伟┘?xì)胞系HepG2中通過(guò)兩種方

4、式異位表達(dá)miR-155，觀察肝細(xì)胞天然免疫功能的變化，分析其作用機(jī)制，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步研究了miR-155異位表達(dá)對(duì)于乙肝病毒X基因復(fù)制的抑制作用。
　　 方法：
　　 1．miRNA表達(dá)載體構(gòu)建：用PCR的方法將miRNA的前體序列從人基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)，插入真核表達(dá)載體pcDNA3中，通過(guò)酶切分析和DNA序列測(cè)定確定連入載體的miRNA序列正確。
　　 2．細(xì)胞轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將miR-155過(guò)

5、表達(dá)質(zhì)?；騧iR-155模擬物及相應(yīng)的對(duì)照轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞；將PAA/HBV1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞。
　　 3．MTT法檢測(cè)miR-155異位表達(dá)后HepG2細(xì)胞的增殖。
　　 4．RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)mRNA和HBVX基因的表達(dá)水平。
　　 5．Westem Blot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子
　　 1

6、(SOCS1)，以及細(xì)胞內(nèi)磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(p-STAT1)和磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因3(p-STAT3)蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功構(gòu)建了 pcDNA3-hsa-miR-155、pcDNA3-mmu-miR-155、pcDNA3-hsa-miR-122、pcDNA3-mmu-miR-451、pcDNA3-hsa-miR-223、pcDNA3-mmu-miR-223等與免疫相關(guān)的mic

7、roRNA過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)酶切和測(cè)序的方法證明序列正確。
　　 2．建立了miR-155穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。
　　 3．miR-155過(guò)表達(dá)的HepG2細(xì)胞增殖能力比對(duì)照組略強(qiáng)，但二者差異不大。
　　 4．過(guò)表達(dá)miR-155可以提高HepG2細(xì)胞中部分抗病毒基因的mRNA和蛋白水平都有所升高。
　　 5．miR-155過(guò)表達(dá)引起HepG2細(xì)胞內(nèi)SOCS1蛋白水平下降，但mRNA水平?jīng)]有明顯變化。

8、>　　 6．miR-155過(guò)表達(dá)引起HepG2細(xì)胞內(nèi)p-STAT1和p-STAT3蛋白水平升高，活化JAK(Janus激酶)/STAT(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子)信號(hào)通路。
　　 7．miR-155過(guò)表達(dá)引起的部分抗病毒蛋白水平升高可以在一定程度上抑制細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制。
　　 結(jié)論：
　　 本研究以肝癌細(xì)胞系HepG2作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)miR-155過(guò)表達(dá)后可以通過(guò)靶向SOCS1而增強(qiáng)JAK/STAT信號(hào)通路，