小麥NBS-LRR抗性基因克隆以及基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化和由發(fā)根農(nóng)桿菌介導的苦蕎遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、小麥NBS-LRR抗性基因克隆以及基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化和由發(fā)根農(nóng)桿菌介導的苦蕎遺傳轉(zhuǎn)化摘要本論文的主要研究內(nèi)容包括：(Ⅰ)通過基因槍遺傳轉(zhuǎn)化法轟擊小麥未成熟胚，獲得攜帶有水稻幾丁質(zhì)酶基因RC24的轉(zhuǎn)基因小麥，對T0和T1代轉(zhuǎn)基因小麥植株的條銹病抗性進行了研究。(Ⅱ)根據(jù)已知抗病基因的保守序列設計引物，分離克隆小麥NBS-LRR類基因同源序列，獲得三條與已知抗病基因同源的序列，并通過Northern印跡雜交技術分析了這三條序列的時空表達情

2、況。(Ⅲ)建立了苦養(yǎng)的植株再生體系及發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，對獲得的再生植株和毛狀根中次生代謝產(chǎn)物蘆丁的含量進行了測定。 Ⅰ.以預培養(yǎng)3-4d的冬小麥品種西農(nóng)88、寶豐7228、黑小麥、鹽2、80101T、甘麥、西農(nóng)1376和西農(nóng)8727開花受粉8～15d后的未成熟胚(大小為0.8～1.5mm)為材料，利用基因槍(型號：PDS1000/氦氣)將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胄←溛闯墒炫叨芷M織。轉(zhuǎn)化過程中一共采用了三種質(zhì)粒組合，質(zhì)粒pYA

3、O24(含有水稻幾丁質(zhì)酶基因RC24和選擇標記基因nptⅡ)轟擊的小麥未成熟胚轉(zhuǎn)至附加150mg幾硫酸卡那霉素的培養(yǎng)基上進行篩選和分化；質(zhì)粒組合pARN6+pDB1(前者含水稻幾丁質(zhì)酶基因RC24,后者含β-葡糖苷酸酶基因gus和選擇標記基因bar)和pBAB3(含水稻幾丁質(zhì)酶基因RC24)+pDB1轟擊的小麥未成熟胚轉(zhuǎn)至附加2mg/L除草劑PPT的培養(yǎng)基上進行篩選和分化。小麥未成熟胚在經(jīng)過轟擊、篩選和分化后，獲得5株再生綠苗。PCR和

4、Southern印跡分析結(jié)果顯示，5株再生植株中4株為陽性，其中質(zhì)粒pYAO24轟擊后獲得1株，質(zhì)粒組合pARN6+pDB1轟擊后獲得1株，質(zhì)粒組合pBAB3+pDB1轟擊后獲得2株，平均轉(zhuǎn)化頻率為0.30％。不同基因型小麥的轉(zhuǎn)化頻率表現(xiàn)出非常顯著的差異：西農(nóng)88的轉(zhuǎn)化效果最好，轉(zhuǎn)化頻率可達1.38％；其次是寶豐7288，轉(zhuǎn)化頻率為0.59％；甘麥的轉(zhuǎn)化頻率為0.49％；從西農(nóng)1376、黑小麥、鹽2、80101T和西農(nóng)8727沒有獲得轉(zhuǎn)

5、基因植株。對轉(zhuǎn)基因小麥進行形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，與對照相比T0代轉(zhuǎn)化植株的分蘗數(shù)、株籽粒數(shù)、千粒重、株高、穗長、節(jié)間數(shù)等均無明顯變化。田間抗條銹菌實驗結(jié)果表明，西農(nóng)88T0和T1代轉(zhuǎn)基因小麥的抗病性最好，為近免疫性，寶豐7228和甘麥的轉(zhuǎn)基因植株分別表現(xiàn)出高度抗病和中度抗病。 Ⅱ.NBS-LRR類基因作為植物抗性基因的一大類，對植物抵御外來侵害有著至關重要的作用。根據(jù)已知植物抗病基因的保守區(qū)域設計引物，從抗銹病小麥品種西農(nóng)88基因組D

6、NA擴增出WRGA1、WRGA2和WRGA14三條與植物抗病基因同源的序列，在NCBI網(wǎng)站上的登錄號分別為AY520908，AY555270，AY550176。氨基酸同源比對和聚類分析結(jié)果表明，它們與GenBank中已登錄的亞麻L6基因(U27081)、小麥Lr21基因(AAQ01784)、小麥Lr10基因(AAO12455)和煙草N基因(U15605)等植物R基因具同源性，并且三個片段可能來自于與小麥Lr21基因同一類型的抗病基因。這

7、三個同源片段均含有典型的NBS-LRR類抗病基因所共同擁有的保守性結(jié)構域Kinase-2a、Kinase-3a和疏水結(jié)構域(HD)，它們與部分已知NBS-LRR類抗病基因的氨基酸序列一致性在46.0％～9.9％之間，其中與Lr21基因的一致性為46.0％～41.1％。三個片段間在氨基酸水平上的一致性為80.7％～56.8％。同源性分析表明，本實驗獲得的三條小麥NBS片段為潛在的抗病候選基因片段。Northern雜交表明WRGA1在小麥中

8、受水楊酸脅迫時表達量增加，屬于受水楊酸正調(diào)控的誘導表達型基因 Ⅲ.首次成功建立了苦蕎的再生體系，并利用發(fā)根農(nóng)桿菌15834感染苦蕎的子葉和下胚軸外植體，誘導產(chǎn)生了毛狀根。在1/2MS無激素培養(yǎng)基上建立了苦蕎的毛根轉(zhuǎn)化系。 以苦蕎無菌苗下胚軸和子葉切塊為材料，在不同的培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導，發(fā)現(xiàn)在MS基本培養(yǎng)基中附加2.0mg幾2，4-D、0.5mg/L6-BA，10mg/LAgNO3和3％蔗糖時，愈傷組織的誘導頻率可

9、以達到92.61％。愈傷組織在附加2mg/L6-BA、0.5mg/LNAA和3％蔗糖的MS培養(yǎng)基上可以再生出叢生芽，繼而發(fā)育成苗，不定芽的誘導率可達30.6％。分化苗或其莖切段在附加3％蔗糖的1/2MS0培養(yǎng)基上出現(xiàn)根的分化，將再生植株經(jīng)煉苗后移栽至營養(yǎng)土，成活率在80％以上。同時測定了再生植株各器官的蘆丁含量，再生植株葉片、根、莖和花中的蘆丁含量(干重)分別為0.3242mg/g、0.0040mg/g、0.0344mg/g和0.446

10、0mg/g。測定結(jié)果顯示，再生植株葉片中的蘆丁含量為大田生長苦蕎葉片中蘆丁含量(干重)的1.01倍；而再生植株根、莖和花的蘆丁含量均略低于大田生長苦蕎相應器官的蘆丁含量(干重)，再生植株根的蘆丁含量是大田苦蕎根蘆丁含量的0.61倍；再生植株莖的蘆丁含量是大田苦蕎莖蘆丁含量的0.34倍；再生植株花的蘆丁含量是大田苦蕎花蘆丁含量的0.63倍。 發(fā)根農(nóng)桿菌15834菌株轉(zhuǎn)化苦蕎下胚軸時，毛狀根誘導率較高，達到28.33％。產(chǎn)生的毛狀根

11、在1/2MS無激素固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中均能生長，但在1/2MS液體培養(yǎng)基(30g幾蔗糖)中生長更為迅速。培養(yǎng)20天后，固體培養(yǎng)基中毛狀根的鮮重增加13.50±0.60倍，液體培養(yǎng)基中毛狀根的鮮重增加近千倍。在兩種培養(yǎng)基中毛狀根的生長狀態(tài)相似，在培養(yǎng)的第4～5天開始迅速生長，第15～17后生長趨于平緩。在15g幾～75g幾的蔗糖濃度范圍內(nèi)，30g幾蔗糖濃度對毛狀根的生長最為適合。PCR和冠癭堿紙電泳證明rol基因已經(jīng)整合到宿主的染色體