蘇云金芽孢桿菌vip3A基因鑒定、克隆及殺蟲活性分析.pdf

1、本研究系統(tǒng)地進(jìn)行了vip3A基因的PCR-RFLP(多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性)鑒定，目前，國內(nèi)外還未見正式報(bào)道。通過此方法對實(shí)驗(yàn)室保存的606株蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，簡稱Bt.)菌株的vip3A(營養(yǎng)期殺蟲蛋白；VIP)基因型進(jìn)行了鑒定；對BtAL和Bt41兩Bt菌株所含的cry和vip3A基因型進(jìn)行了鑒定；完成了菌株BtALvip3A因的克隆、表達(dá)及對甜菜夜蛾(Spodopteraexi

2、gua)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和玉米螟(Ostriniafurnacalis)幼蟲的生物活性測定；并克隆得到Bt41中vip3A的基因片段。 本研究建立了PCR-RFLP的方法，篩選vip3A基因。此方法根據(jù)五種vip3A基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對通用引物，用來擴(kuò)增vip3A基因的1,456bps的基因片段，此片段經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后，電泳檢測酶切

3、條帶大小，根據(jù)電泳圖譜，確定基因類型。通過此方法，從鑒定的606株Bt菌株中有382株得到vip3A基因擴(kuò)增產(chǎn)物，約占總數(shù)的63﹪，說明vip3A基因的分布廣泛。根據(jù)酶切電泳顯示，共有三種RFLP圖譜，315株含有與已知vip3Aa1相同的電泳圖譜(860，260，190和160bps)，另外發(fā)現(xiàn)兩種新的RFLP圖譜與已知5種基因不同，其中52株(含菌株BtAL)的電泳圖譜顯示860，260，160，150bps條帶；15株(含菌株Bt

4、41)的電泳圖譜顯示1，100，190和160bps，均不同于其他已知vip3A的RFLP圖譜。 對含有新vip3A基因的BtAL菌株質(zhì)粒DNA進(jìn)行cry和vip3A基因鑒定，發(fā)現(xiàn)其含有cry1Ab，cry1Ca，cry1Cb，cry1Fb，cry1Bd，cry1Ib，cry2Ab，cry9Eb和新型vip3A基因。以BtAL菌株質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增得到2.37kbvip3A基因產(chǎn)物，插入到表達(dá)載體pET-21b上，得到重組質(zhì)粒

5、pBvip，完成克隆和測序，并將序列提交GenBank登記，Accessionnumber為DQ241674，Bacillusthuringiensis殺蟲晶體蛋白命名委員會命名為Vip3Aa19。序列分析表明Vip3Aa19蛋白由789個(gè)氨基酸組成，分子量為88.7kDa，該蛋白等電點(diǎn)為pH5.17，為弱酸性蛋白。與所有的Vip3類蛋白作了同源關(guān)系分析，此蛋白與已知Vip3Aa12具有最高為97.6﹪的序列同源性，存在19個(gè)氨基酸殘基

6、的不同。將含有pBvip質(zhì)粒的大腸桿菌在0.7mmol/LIPTG，18℃，130r/min條件下，誘導(dǎo)表達(dá)18小時(shí)，提取表達(dá)產(chǎn)物，SDS-PAGE分析表明vip3Aa19基因在E.coli中表達(dá)蛋白為可溶的。生物活性測定表明表達(dá)產(chǎn)物對甜菜夜蛾幼蟲具有顯著的殺蟲活性，LC50為1.43ng/mg飼料；對棉鈴蟲和小菜蛾幼蟲也具有顯著的殺蟲活性，LC50分別為24.14ng/mg飼料和59.82μg/mL；但此蛋白對玉米螟活性不高，LC50

7、大于100μg/mL，只具有一定的體重抑制作用。 對含有新vip3A基因的Bt41菌株質(zhì)粒DNA進(jìn)行cry和vip3A基因鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株Bt41含有cry1Aa，cry1Cb，cry1Ie和一種新型vip3A基因。并從Bt41菌株中克隆得到了vip3A的基因片段1,456bps，測序結(jié)果顯示其蛋白序列與已知Vip3Af1具有83﹪的序列同源性。在GenBank登記，Accessionnumber為DQ250256. 本研