基于長片段PCR擴(kuò)增的貝類皰疹病毒全基因組高通量測序及變異分析.pdf

1、20世紀(jì)70年代美國首次出現(xiàn)皰疹病毒感染軟體動(dòng)物（一批養(yǎng)殖試驗(yàn)用美洲牡蠣）的案例，但并未對當(dāng)?shù)睾腿蚱渌貐^(qū)牡蠣和貝類養(yǎng)殖業(yè)造成損害。然而進(jìn)入90年代后，皰疹病毒感染引起的牡蠣、扇貝、蛤類和鮑等貝類的死亡案例在全球范圍內(nèi)（主要包括歐洲、美國、澳洲以及我國）頻繁發(fā)生，給當(dāng)?shù)刎愵愷B(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)形態(tài)學(xué)電鏡觀察、病毒分離純化和全基因組測序比對后，兩種新皰疹病毒：牡蠣皰疹病毒（Ostreid herpesvirus1，OsHV-1）和

2、鮑皰疹病毒（Haliotid herpesvirus1，HaHV-1）被相繼鑒定出來。OsHV-1和HaHV-1同隸屬于軟體動(dòng)物皰疹病毒科（Malacoherpesviridae），是該病毒科下唯一已知的兩個(gè)病毒種。OsHV-1屬于牡蠣皰疹病毒屬（Ostreavirus），可感染多種雙殼貝類；HaHV-1屬于鮑皰疹病毒屬（Aurivirus），感染單殼貝類。
　　隨時(shí)間的發(fā)展，OsHV-1也發(fā)生了較強(qiáng)的株系分化。但受制于技術(shù)所限，

3、對不同年代變異株基因組序列信息的掌握甚少。本研究嘗試?yán)没陂L片段PCR方法的貝類皰疹病毒基因組富集技術(shù)，對低溫凍存的多年份櫛孔扇貝及魁蚶感染OsHV-1和九孔鮑感染HaHV-1的基因組進(jìn)行富集，使用高通量測序技術(shù)獲取OsHV-1不同變異株序列信息，并分析了不同變異株與其他變異株的基因組變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究方法及部分結(jié)果如下：
　　第一部分：建立一套對于長期低溫凍存貝類病料樣本中牡蠣皰疹病毒的基因組富集方法，通過病毒懸液法提取

4、病毒基因組DNA，根據(jù)參考基因組（207,439 bp）設(shè)計(jì)23對引物，使用Takara高保真聚合酶GXL擴(kuò)增了2001年份凍存的櫛孔扇貝牡蠣皰疹病毒全基因組，并使用Illumina Hiseq PE2500高通量測序平臺(tái)進(jìn)行第二代測序；同時(shí)使用PacBio RS II系統(tǒng)進(jìn)行第三代高通量測序（SMRT）。第二代測序共獲得8個(gè)Scaffolds，分別為170,095、18,675、1929、1805、1395、834、825和600 b

5、p。第三代測序獲得117,873個(gè)clean subreads，平均長度7202 bp。組裝后對于基因組末端序列以及有問題的區(qū)域通過Sanger測序以及二代測序作進(jìn)一步驗(yàn)證。修補(bǔ)后獲得長204,783 bp的全基因組序列。基于11個(gè)OsHV-1變異株的32個(gè)ORF基礎(chǔ)上進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示，2001年份分離的OsHV-1變異株與2009年分離自我國櫛孔扇貝的AVNV親緣關(guān)系最近，而與2008年以后出現(xiàn)的OsHV-1μvar及其相關(guān)

6、變異株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。OsHV-1變異株間的親緣關(guān)系受到宿主及時(shí)空分布范圍的影響。研究表明，本試驗(yàn)建立的OsHV-1基因組富集方法易用且有效。
　　第二部分：利用新建立的從凍存貝類病料中擴(kuò)增牡蠣皰疹病毒基因組的富集方法，成功擴(kuò)增了多年份櫛孔扇貝病料（2002年、2003年、2004年、2008年）及2015年魁蚶病料中OsHV-1的基因組。構(gòu)建小片段文庫，通過Illumina Hiseq PE2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行變異序

7、列分析。多年份病毒株第二代測序分別獲得長度為180,686 bp、182,857 bp、190,414 bp、173,253 bp和192,676 bp的基因組。測序序列GC含量分別為38.6％（ZK2002）、38.8%（ZK2003）、38.9%（ZK2004）、38.8%（ZK2008）、38.5%（KH2015）。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示多年份櫛孔扇貝OsHV-1變異株與AVNV親緣關(guān)系最近，而與2008年以后出現(xiàn)的OsHV-1μv

8、ar及其相關(guān)變異株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2015年OsHV-1魁蚶株與2012年分離自我國魁蚶的Os HV-1-SB親緣關(guān)系最近。本研究建立的基因組富集方法可以適用于OsHV-1不同變異株基因組的富集，并進(jìn)行后續(xù)的變異序列分析。
　　第三部分：參照新建立的從凍存貝類病料中擴(kuò)增牡蠣皰疹病毒基因組的富集方法，建立起擴(kuò)增鮑皰疹病毒基因組富集方法。通過病毒懸液法提取病毒基因組DNA，根據(jù)參考基因組設(shè)計(jì)引物，使用Takara高保真聚合酶GXL擴(kuò)增