原肌球蛋白-4抗體靶向標(biāo)記合成型血管平滑肌細(xì)胞MRI體外成像的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)來源于胚胎中胚層，是血管壁中膜層的重要組成成分，對(duì)血管張力、血流動(dòng)力學(xué)等具有重要的調(diào)節(jié)作用。在血管內(nèi)膜損傷、炎癥因子刺激等因素作用下，VSMC去分化重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，獲得去分化表型，即合成型，伴隨增殖、遷移、凋亡壞死等病理改變，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄、主動(dòng)脈夾層等血管性病變的發(fā)生。因此合成型VSMC是診斷及防治血管性疾病的研究重點(diǎn)。平滑肌胚胎型肌

2、球蛋白重鏈(SMemb)、視黃醇結(jié)合蛋白-1(CRBP-1)、原肌球蛋白-4(TPM-4)等合成型標(biāo)記蛋白的確定為合成型VSMC的鑒定及研究提供了更為精確的靶點(diǎn)。
　　分子影像學(xué)借助無創(chuàng)性的影像手段在活體內(nèi)實(shí)時(shí)、重復(fù)的顯示靶細(xì)胞及其分子變化的信息，并對(duì)其生物學(xué)行為進(jìn)行定量和定性研究。隨著血管性疾病的生物學(xué)發(fā)生機(jī)制以及防治方法研究的進(jìn)展，分子影像學(xué)成為其早期診斷以及療效評(píng)估的重要方法。研究主要聚焦于疾病形成的機(jī)制、體外活體特異性探測(cè)

3、、預(yù)防治療效果評(píng)價(jià)等，分子成像方式以核素、MRI兩種分子成像技術(shù)為主。其中，MRI分子成像具有高空間分辨率、多序列成像等優(yōu)點(diǎn)，能夠在傳統(tǒng)MRI技術(shù)的基礎(chǔ)上，以特殊分子或細(xì)胞作為成像對(duì)象，把傳統(tǒng)的物理成像轉(zhuǎn)為特異性分子水平的分子成像，為VSMC的靶向性分子成像提供了廣闊的應(yīng)用空間。
　　超順磁性氧化鐵(SPIO)、超微超順磁性氧化鐵(USPIO)等對(duì)比劑標(biāo)記細(xì)胞示蹤技術(shù)在MRI分子成像研究中最為常見，但由于SPIO、USPIO等對(duì)比

4、劑本身負(fù)電荷特性以及VSMC不具備主動(dòng)吞噬USPIO功能等原因，使VSMC的MRI分子成像研究受到了一定的限制。本研究對(duì)頸動(dòng)脈再狹窄模型MRI成像、再狹窄形成過程中合成型VSMC分布、高合成型VSMC體外分離及鑒定、靶向標(biāo)記蛋白(TPM-4)表達(dá)變化等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，采用免疫分子成像技術(shù)構(gòu)建TPM-4抗體靶向型MRI探針，探討靶向合成型VSMC分子影像學(xué)研究的可行性，為血管性疾病的早期診斷以及療效評(píng)估提供更為精確科學(xué)的參照。本文主要

5、分為以下3部分內(nèi)容:
　　第一部分:大鼠血管再狹窄形成中MRI成像及血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究
　　球囊損傷法建立SD大鼠再狹窄(RS)模型，于損傷后24h、1w、2w、4w、8w分別行7.0T MRI掃描(T1WI、T2WI、PDWI)，取損傷側(cè)血管HE染色觀測(cè)病理學(xué)變化，測(cè)量計(jì)算新生內(nèi)膜面積(IA)、內(nèi)膜增生指數(shù)(IHI)、管腔面積(LA)及狹窄率，并與MRI圖像測(cè)量結(jié)果行相關(guān)性分析;免疫組織化學(xué)染色分別鑒定收縮型

6、、合成型VSMC的分布(SMA、SMemb)，測(cè)定損傷后不同時(shí)間點(diǎn)(1w、2w、4w、8w) VSMC表型特異性蛋白表達(dá)量變化及增殖活性改變。本部分旨在通過建立SD大鼠頸動(dòng)脈RS模型，采用7.0T MRI動(dòng)態(tài)觀測(cè)再狹窄形成過程，研究VSMC在再狹窄形成過程中的表型轉(zhuǎn)化，并探討靶向合成型VSMC分子成像研究的可行性。
　　第二部分:合成型血管平滑肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究
　　采用改良Ⅱ型膠原酶消化法分離、體外培養(yǎng)SD大

7、鼠胸主動(dòng)脈VSMC，通過血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)處理獲取高合成型VSMC; MTT比色法及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)分析細(xì)胞增殖活性與遷移活性;流式細(xì)胞周期測(cè)定細(xì)胞周期分布;倒置顯微鏡、結(jié)晶紫染色觀察形態(tài)學(xué)改變并定量分析;免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定VSMC并測(cè)定分析收縮型標(biāo)記蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)以及合成型標(biāo)記蛋白SMemb、TPM-4表達(dá)量的變化。本部分旨在探討以簡(jiǎn)便高效的方法獲取VSMC，并分離、培養(yǎng)、鑒定處于高合成表型

8、狀態(tài)下VSMC，為血管性疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分:抗體靶向型MRI探針的制備及血管平滑肌細(xì)胞體外成像的實(shí)驗(yàn)研究
　　體外分離培養(yǎng)合成型VSMC與內(nèi)皮細(xì)胞并行細(xì)胞鑒定;免疫熒光雙重染色驗(yàn)證合成型VSMC高表達(dá)TPM-4蛋白;應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)法合成靶向TPM-4 MRI分子探針(TPM4-USPIO);采用普魯士藍(lán)染色分析探針特異靶向性，MTT比色法分析不同鐵濃度條件下對(duì)細(xì)胞體外生物學(xué)活性的影響;通過7.0T MRI掃