天然免疫分子TLR4在腎移植受者中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、遺傳基因不同的個體之間的器官移植，由于供、受體移植抗原的不同，可引起宿主的免疫反應(yīng)，即排斥反應(yīng)（rejection response）。隨著腎移植技術(shù)的不斷成熟和新型免疫抑制的應(yīng)用，腎移植的成功率較以往大大改善，在防治腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)及各種并發(fā)癥方面取得了較大進(jìn)展，國內(nèi)外的移植中心也積累了豐富的治療經(jīng)驗。但是，排斥反應(yīng)仍然是影響腎移植長期效果的重要因素。雖然近年關(guān)于腎移植術(shù)后排斥反應(yīng)的基礎(chǔ)和臨床研究取得較大進(jìn)展，但其發(fā)生的具體機(jī)制目前

2、仍不是十分清楚。 目前的研究結(jié)果表明，器官移植后排異反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制和發(fā)生過程包括：移植物損傷、抗原的處理與遞呈、抗原的識別與T細(xì)胞活化、免疫應(yīng)答的生成與效應(yīng)。在移植免疫中，T淋巴細(xì)胞在雙信號刺激下才能被激活和發(fā)生增殖，從而啟動由淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、補(bǔ)體等參與的錯綜復(fù)雜的移植排斥反應(yīng)。如果抗原提呈細(xì)胞（antigen present cell，APC）只提供MHC-抗原肽復(fù)合物而不提供CD80、CD86等共刺激信號，將使淋巴細(xì)胞無

3、能，誘導(dǎo)免疫耐受。 當(dāng)前，國內(nèi)外關(guān)于移植免疫的研究主要集中在以T/B淋巴細(xì)胞及其下游細(xì)胞因子為中心的獲得性免疫（adaptive immunity）過程，并取得了較大進(jìn)展。顯然，針對淋巴細(xì)胞活化的上游信號傳導(dǎo)者APC的干預(yù)措施，可以從源頭上找到抑制移植免疫活化的靶點，在防治急性排斥反應(yīng)方面將具有顯而易見的優(yōu)勢。 天然免疫（innate immunity）是機(jī)體抵御外來入侵的第一道屏障，不僅可以直接殺傷外來入侵者，還可以將

4、外來抗原提呈給T淋巴細(xì)胞，啟動獲得性免疫應(yīng)答。APC表面共刺激分子（costimulatory molecule）的表達(dá)是決定T細(xì)胞對異基因免疫反應(yīng)性的關(guān)鍵因素。APC表面CD80、CD86等共刺激分子的下調(diào)可以使APC轉(zhuǎn)變?yōu)橹履褪苄约?xì)胞，使T細(xì)胞失去發(fā)生異基因反應(yīng)的能力。但問題是，CD80、CD86的表達(dá)是如何調(diào)控的？由誰調(diào)控？ 本研究首先以人外周血CD14陽性單核細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用三色標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)，對天然免疫分子TLR4

5、及其下游分子CD80在腎移植圍手術(shù)期表達(dá)的變化規(guī)律進(jìn)行監(jiān)測，并研究TLR4與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系；考慮到TLR4的表達(dá)在圍手術(shù)期可能被移植手術(shù)、應(yīng)激反應(yīng)、圍手術(shù)期用藥等影響，因此本文選取腎移植手術(shù)1年以后的患者為研究對象，以觀察TLR4在此類患者發(fā)生急性排斥反應(yīng)時的表達(dá)情況及其對激素沖擊治療的反應(yīng)；最后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測TLR4在發(fā)生排斥反應(yīng)的移植腎組織的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討TLR4參與急性排斥反應(yīng)的證據(jù)。 通過研究T

6、LR4在腎移植受者中的表達(dá)情況，本文旨在探討如下問題：1、TLR4水平的高低是否可以預(yù)測腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險?2、TLR4在臨床腎移植圍手術(shù)期的動態(tài)變化規(guī)律及其與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系?3、腎移植遠(yuǎn)期發(fā)生急性排斥反應(yīng)時TLR4的表達(dá)情況及抗排斥治療對其影響；4、TLR4水平是否可以評估移植腎功能的長期預(yù)后?5、TLR4在發(fā)生急、慢性排斥反應(yīng)的移植腎組織中的表達(dá)情況。 第一章、腎移植圍手術(shù)期患者Toll樣受體4/CD80測

7、定及其意義。 目的 ：為研究圍手術(shù)期TLR4在移植免疫中的作用，以CD14陽性單核細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察TLR4/CD80在腎移植圍手術(shù)期的變化規(guī)律及其與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系，探討TLR4參與圍手術(shù)期急性排斥反應(yīng)的可能機(jī)制。 方法：選取初次腎移植受者32例，所有受者術(shù)前群體反應(yīng)抗體檢測均陰性。流式細(xì)胞術(shù)測定受者腎移植術(shù)前及術(shù)后第1、4、7、14、21、28、35d外周血單核細(xì)胞TLR4/CD80表達(dá)的百分率；根據(jù)腎移植術(shù)后2周

8、內(nèi)發(fā)生排斥與否將患者分為排斥組（7例）和無排斥組（25例）。選取10例PRA陰性的健康成年志愿者為正常對照組。急性排斥反應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、移植腎多普勒超聲檢查、必要時行移植腎穿刺活檢等綜合判斷。實驗組測量值用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組間比較應(yīng)用單因素方差分析（One-Way ANOVA）、不同時間點的比較應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析，P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

9、 結(jié)果：腎移植術(shù)前，外周血單核細(xì)胞TLR4、CD80的表達(dá)：排斥組為8．03±0．84%、0．85±0．31%（n=7），無排斥組為6．14±0．85%、0．84±0．39%（n=25），正常對照組為6．37±0．56%、0．85±0．35%（n=10）；排斥組TLR4的表達(dá)顯著高于無排斥組和正常對照組（P<0．01），無排斥組與正常對照組比較無顯著差異（P=0．448）；三組之間CD80的表達(dá)無顯著差異（P=0．995）。腎移植術(shù)

10、后，患者單核細(xì)胞TLR4/CD80的表達(dá)在第4d開始出現(xiàn)升高趨勢，排斥組為16．5±1．02%、7．82±1．66%，無排斥組為11．6±0．98%、2．26±0．96%，較術(shù)前均顯著升高（P<0．01）；第7天左右達(dá)高峰，排斥組為36．4±4．86%、9．53±1．97%，無排斥組為22．7±3．45%、1．87±0．72%，并隨著腎功能的恢復(fù)逐漸回落，排斥組于第35天降至7．10±0．82%、0．87±0．57%，無排斥組第21天降

11、至7．2±0．76%、0．81±0．37%；與無排斥組相比較，排斥組TLR4/CD80表達(dá)的峰值較高（P<0．01），且持續(xù)時間較長。 結(jié)論：術(shù)前單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)水平可以預(yù)測腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險，高TLR4的腎移植受者易于發(fā)生急性排斥反應(yīng)；TLR4在腎移植術(shù)后早期上調(diào)，并隨著腎功能的恢復(fù)逐漸回落至術(shù)前水平，圍手術(shù)期發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者，TLR4/CD80表達(dá)的峰值較高，持續(xù)時間較長；天然免疫分子TLR4通

12、過刺激下游分子CD80的表達(dá)，啟動獲得性免疫反應(yīng)，參與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。 第二章、Toll樣受體4在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中的檢測及意義。 目的：研究外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4）在腎移植術(shù)后遠(yuǎn)期急性排斥反應(yīng)發(fā)生時的表達(dá)情況，及甲基強(qiáng)的松龍（MP）治療對TLR4的表達(dá)的影響。探討TLR4在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)監(jiān)測中的臨床應(yīng)用價值。 方法：選取13例腎移植手術(shù)1年后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者，應(yīng)用流式細(xì)

13、胞術(shù)測定甲基強(qiáng)的松龍（MP）沖擊治療前、后外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4表達(dá)的百分率，并與20例未發(fā)生排斥反應(yīng)的移植腎功能正?；颊呦啾容^，20例健康志愿者作為正常對照。腎移植術(shù)后遠(yuǎn)期急性排斥反應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、尿量減少、血壓升高、移植腎區(qū)脹痛、體重增加、尿蛋白增多、血肌酐升高，排除感染、外傷、嚴(yán)重心、腦血管疾病等。（2）彩色多普勒超聲檢查顯示腎血管阻力指數(shù)升高，排除其他原因如梗阻、腎動脈狹窄等引起的腎功能損害。（3）

14、腎活檢病理符合移植腎急性排斥反應(yīng)病理表現(xiàn)（Banff標(biāo)準(zhǔn)），排除慢性排斥反應(yīng)、急性環(huán)孢素A腎中毒等原因?qū)е碌哪I功能損害。實驗組測量值用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計學(xué)方法采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4表達(dá)的百分率（30．45±5．17

15、%）顯著高于移植腎功能正常組（6．01±0．93%，P<0．01）及正常對照組（7．15±0．85%，P<0．01）；MP沖擊治療兩周后，發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者TLR4的表達(dá)顯著下降（P<0．01），其下降程度與激素治療敏感與否有關(guān)。 結(jié)論：TLR4在腎移植遠(yuǎn)期的急性排斥反中表達(dá)上調(diào)，MP沖擊治療顯著降低TLR4的表達(dá)水平；激素治療不敏感的患者，TLR4表達(dá)的水平較高；TLR4水平的監(jiān)測似乎可以作為糖皮質(zhì)激素治療敏感性的判斷指標(biāo)

16、；高TLR4水平可能提示移植腎功能預(yù)后不良。 第三章、Toll樣受體4在腎移植術(shù)后移植腎組織中的表達(dá)。 目的：研究Toll樣受體4（TLR4）在腎移植術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)移植腎組織中的表達(dá)情況，探討TLR4參與移植免疫的相關(guān)機(jī)制。 方法：選取2007年3月～2008年12月我院腎移植術(shù)后發(fā)生急、慢性排斥反應(yīng)的移植腎組織標(biāo)本各10例，正常腎組織標(biāo)本10例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法并結(jié)合移植腎病理分級（Banff標(biāo)準(zhǔn)），

17、分析TLR4在移植腎組織中的表達(dá)情況。采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫。兩組間的均數(shù)比較用獨立樣本t檢驗；多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0．05為差異有顯著性意義。 結(jié)果：三組移植腎組織標(biāo)本均有TLR4的表達(dá)。急性排斥反應(yīng)組與慢性排斥反應(yīng)組的表達(dá)強(qiáng)度均高于正常組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0．000），而急性排斥反應(yīng)組與慢性排斥反應(yīng)組之間無顯著差異（P=0．889）。在急性排斥反應(yīng)組中，TL