甘藍(lán)型油菜caleosin基因克隆與表達(dá).pdf

1、除了豐富蛋白質(zhì)oleosin，油菜種子油體中還存在有三種微量蛋白質(zhì)，caleosin，steroleosin和Sop3。編碼兩親性oleosin蛋白的基因已經(jīng)在甘藍(lán)型油菜中被分離克隆。本論文應(yīng)用同源序列克隆法設(shè)計(jì)同源簡并引物，結(jié)合RT-PCR和RACE-PCR等技術(shù)首次從甘藍(lán)型油菜中成功分離克隆了編碼caleosin蛋白的基因，分析了ealeosin蛋白和caleosin基因的結(jié)構(gòu)特征。從甘藍(lán)型油菜各種發(fā)育階段的種子中提取mRNA，用甘

2、藍(lán)型油菜caleosin基因特異性探針進(jìn)行Northern雜交研究了caleosin基因mRNA的表達(dá)特征和表達(dá)轉(zhuǎn)錄體帶型。Caleosin基因被成功插入到表達(dá)載體pTYB12中，并在大腸桿菌ER2566中完成了原核表達(dá)。本論文主要的研究結(jié)果如下。 提出了一種從油菜種子中有效地提取高質(zhì)量總RNA的方法──熱CTAB-LiCL聯(lián)用法。提取的RNA樣品具有較高的純度和完整性。變性膠電泳后為28S和18SrRNA二條完整的帶型，A26

3、0／A280比值在1.8-2.0之間，得率高約為1mg<,（RNA）>／g<,（樣品）>。提取的。RNA完整無降解，并克服了多酚、多糖及次生物質(zhì)等的干擾，完全適合RT-PCR、全長基因的克隆及Northern Blotting等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。 甘藍(lán)型油菜caleosin基因mRNA序列登陸GenBank，序列號(hào)為AY966447。mRNA全長序列為1058bp，包含了完整的開放閱讀框和3’末端Poly（A）尾巴結(jié)構(gòu)。mR

4、NA開放閱讀框區(qū)域?yàn)榈?7位至774位之間的738bp的序列片斷，能夠編碼245個(gè)氨基酸殘基的caleosin蛋白。Caleosin基因mRNA序列已經(jīng)達(dá)到了3’最末端。但是通過序列分析沒有發(fā)現(xiàn)caleosin基因mRNA序列5’端具有帽子結(jié)構(gòu)。這有兩種可能：一種是5’RACE-PCR并沒有擴(kuò)增到caleosin基因mRNA序列5’最末端；另一種是甘藍(lán)型油菜caleosin基因轉(zhuǎn)錄mRNA后序列5’端本身就沒有加上帽子結(jié)構(gòu)。 甘

5、藍(lán)型油菜caleosin基因組DNA序列長為1676bp，登陸GenBank，序列號(hào)為DQ140380。Caleosin基因在基因組序列結(jié)構(gòu)上具有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子的剪接符合真核生物內(nèi)含子剪接的GT／AG規(guī)則：即內(nèi)含子的5’端總是GT和3’端總是AG。 甘藍(lán)型油菜caleosin基因編碼的油體結(jié)合蛋白caleosin在GenBank上的序列號(hào)為AAY40837。Caleosin蛋白由245個(gè)氨基酸殘基組成，包含了20

6、種常見氨基酸，分子量為28.096kD，等電點(diǎn)5.81。蛋白質(zhì)性質(zhì)分析表明甘藍(lán)型油菜caleosin蛋白為兩性蛋白質(zhì)，帶電荷氨基酸和疏水性氨基酸的含量比較高且基本相同。親水性圖和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明caleosin蛋白主要可以劃分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：由N末端1-16位氨基酸殘基組成的α－螺旋（Alpha helix）和17-61位氨基酸殘基組成的強(qiáng)親水性的隨機(jī)卷曲（Random coil）構(gòu)成的N-末端親水性結(jié)構(gòu)域；由80-120位氨基酸殘基組成

7、的中間疏水性結(jié)構(gòu)域和C-末端親水性結(jié)構(gòu)域。N-末端親水性結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)潛在的結(jié)合Ca<'2+>的EF-手結(jié)構(gòu)。中間疏水性結(jié)構(gòu)域包含有一個(gè)潛在的脯氨酸-結(jié)（Proline-Knot）模體，在92-114位氨基酸殘基組成的α－螺旋跨膜區(qū)域，推測(cè)在caleosin蛋白與單層磷脂層和油體錨定結(jié)合上起到重要的作用。 甘藍(lán)型油菜胚胎中caleosin基因mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是由胚胎發(fā)育來調(diào)控的，具有顯著的“時(shí)、空”特性。Northern雜交結(jié)

8、果表明caleosin基因在甘藍(lán)型油菜花后前20天左右發(fā)育的種子中檢測(cè)不到mRNA的表達(dá)，直到花后發(fā)育25天左右的種子中才開始有mRNA的表達(dá)，并且只有一條mRNA表達(dá)帶型?；ê蟀l(fā)育30天左右的種子中caleosin基因mRNA的表達(dá)量急劇增加到最高值，之后caleosin基因一直保持著很高的mRNA表達(dá)水平。推測(cè)甘藍(lán)型油菜中caleosin基因在種子胚胎發(fā)育中期開始表達(dá)，在種子胚胎發(fā)育后期即種子脫水期高量穩(wěn)定地表達(dá)。在油菜種子胚胎發(fā)育

9、期間，caleosin基因mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時(shí)間模式類似于oleosin基因。推測(cè)在其它含油植物中油體結(jié)合蛋白基因oleosin，caleosin和Sop2轉(zhuǎn)錄的mRNA的富集時(shí)間模式也可能是一致的。 甘藍(lán)型油菜caleosin基因在大腸桿菌中成功完成小量誘導(dǎo)表達(dá)。優(yōu)化的誘導(dǎo)條件為：在100ml無菌三角瓶中加入50ml含100μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基，500μl重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌ER2566細(xì)胞菌液，于37℃