轉(zhuǎn)錄因子GATA2突變和慢性粒細胞白血病急性變機制研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病CHRONICMYELOGENOUSLEUKEMIA(CML)是起源于多能造血干細胞的惡性克隆增殖性疾病，慢性粒細胞白血病病程通常分為三個階段，即慢性期(chronicphaseCP)；加速期(acceleratephaseAP)及急變期(blastcrisisBC)。慢性期主要表現(xiàn)為粒系增生，骨髓、外周血和脾臟中大量粒細胞積聚，慢性期持續(xù)大約3-5年左右，慢性粒細胞白血病患者進入加速期，加速期一般持續(xù)4-6個月，加速期

2、原始細胞，不成熟細胞比例增高，最后進入終末期-急變期。急變期骨髓和外周血中原始細胞大量積聚，類似于急性白血病表現(xiàn)。那么慢性粒細胞白血病急性變的潛在機制是什么呢?如果能夠探明其具體機制，就有望將慢性粒細胞白血病阻滯在慢性期，延緩或者切斷其急變，這將會給患者帶來福音。另外對于已經(jīng)處于急變期的患者，也可以設(shè)計一些針對急變機制的靶向新療法以期提高患者生存質(zhì)量。 鑒于此，慢粒急變機制的研究一直是白血病科研領(lǐng)域研究的熱點。Gilliland

3、等提出了白血病發(fā)病機制的多次打擊學(xué)說，他們認為急性白血病的發(fā)生需要至少2個遺傳學(xué)事件，其中一個事件為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子異常賦予細胞生長增殖優(yōu)勢如FLT3受體突變或BCR/ABL融合蛋白，而另外的分子事件為轉(zhuǎn)錄因子異常如PML-RARα能夠阻止細胞分化，只有具備這兩類分子事件，急性白血病才會發(fā)生，這個理論也適宜于闡述慢性粒細胞白血病急變機制，慢性期在BCR/ABL伴蛋自酪氨酸激酶活性持續(xù)升高作用下，細胞具有很強的增殖優(yōu)勢，但是急變期主要表現(xiàn)為細

4、胞分化受阻，因此慢性粒細胞白血病急變可能需要其他能夠影響細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子異常分子事件協(xié)同。上海血液學(xué)研究所實施了旨在闡明白血病發(fā)病機制，尋找亞型特異基因組異常的“白血病基因組解剖學(xué)計劃”。我們對85例慢?；颊吆Y查了一組轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)9例患者在急變期伴隨有特異性GATA-2突變，其中8例患者急變期出現(xiàn)GATA-2CDS(codingsequence)第1075位堿基T＞G雜合突變，引起相應(yīng)GATA2蛋白第359位氨基酸從亮氨酸突變?yōu)槔i氨

5、酸(L359V)，另外一例患者急變期出現(xiàn)GATA-2CDS第1021到第1038位18bp堿基缺失，引起GATA2蛋白第341位至第346位氨基酸的缺失(Δ341-346)。有趣的是伴GATA2突變的9例患者均向粒/單核系細胞急性變。 第一部分：對GATA2的這兩種突變蛋白做了相應(yīng)的功能研究。PU.1和CEBPα是調(diào)控造血干細胞向髓系細胞分化的兩種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其中PU.1主要調(diào)控單核細胞及粒細胞分化，CEBPα主要調(diào)控粒細胞

6、的分化。PU.1缺失的小鼠能發(fā)生急性白血病，而CEBPα缺失的小鼠表現(xiàn)為粒細胞成熟障礙。另外，PU.1和CEBPα突變與急性白血病發(fā)生也有很大關(guān)系。M2b患者AML-ETO能夠下調(diào)CEBPα表達，還能抑制PU.1的轉(zhuǎn)錄活性，這可能都和白血病發(fā)病相關(guān)。因此，我們著眼于探索GATA2突變體的功能，以及其與PU.1和CEBPα的關(guān)系，從而對GATA-2突變在慢粒急變中的作用做初步探討。通過免疫共沉淀實驗，體外GST拉下實驗以及螢光素酶激活抑制

7、實驗，我們證實GATA-2L359V和Δ341-346兩種突變蛋白不喪失與PU.1蛋白的結(jié)合；與野生型GATA-2相比較，L359V與PU.1在體外結(jié)合能力更強；與野生型相比較，GATA2L359V和△341-346能更強抑制PU.1的轉(zhuǎn)錄活性，顯示GATA2突變是功能獲得性突變(gainoffunction)。但對于CEBPα的轉(zhuǎn)錄活性抑制，GATA2wt，L359V和△341-346無明顯差異。而PU.1轉(zhuǎn)錄活性減低能引起下游造血細

8、胞分化相關(guān)靶基因表達異常從而引起細胞分化受阻，這可能部分地解釋了伴有GATA2突變CML急性演進的潛在機制。 第二部分和第三部分：在動物模型上，進一步證實GATA2突變在慢性粒細胞白血病急性變中的作用。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)，結(jié)合小鼠造血干細胞移植技術(shù)，使GATA2突變蛋白和BCR-ABL融合蛋白協(xié)同誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性白血病樣疾病。成功地建立了逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)平臺。包裝出高滴度的病毒顆粒，在國內(nèi)首次成功地用BCR-ABL融合基因誘導(dǎo)小鼠

9、發(fā)生了CML樣疾病。而GATA2突變協(xié)同BCR-ABL，組小鼠移植后造血和免疫成功重建，但是GFP陽性細胞比例從2周時的10％左右逐漸下降至零，也就意味著目的基因的表達也呈逐漸下降趨勢，因此未能誘導(dǎo)出預(yù)期的AML樣表型。提示GATA2過表達可能對造血干細胞有一定毒性作用，影響造血干細胞自我更新能力，從而使目的基因不能夠在造血細胞內(nèi)持續(xù)表達發(fā)揮作用。這與GATA2過表達能影響造血干細胞增殖和分化的相關(guān)文獻報道結(jié)果相一致?？赡苄枰M一步借助