大菱鲆腹水癥病原菌的鑒定及其外膜蛋白的抗原性研究.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)自1992年引入我國以來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，疾病的發(fā)生也日益突出，其中弧菌病成為制約大菱鲆養(yǎng)殖的關(guān)鍵因素。本研究從患腹水癥的大菱鲆體內(nèi)分離到一株病原菌，人工感染實驗證實具有致病性，生理生化及分子生物學(xué)方法鑒定為溶藻弧菌(。Vibrio alginolyticus)。用該菌株免疫兔制備抗血清，間接免疫熒光抗體方法檢測抗血清的特異性。用Sarkosyl法提取該菌株與主要水產(chǎn)弧菌及其它屬

2、細(xì)菌的主要外膜蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法分析主要外膜蛋白的結(jié)構(gòu)組成及其抗原性。具體方法和結(jié)果如下： 2002年6月，山東省榮成地區(qū)發(fā)生大規(guī)模的大菱鲆幼魚腹水癥，病魚癥狀為腹水、食欲下降、體表潰瘍、眼球突出等，發(fā)病水溫為16-17℃。本研究從患病魚體腹水中分離純化到的一株優(yōu)勢細(xì)菌SRl，利用SRl對健康大菱鲆幼魚進(jìn)行人工回接感染實驗，確定該菌株SRl為大菱鲆腹水癥的致病菌。經(jīng)計算其半致死量LD<,50>為

3、1.4×10<,6>CFU/尾，表明SRl為較強(qiáng)毒力的菌株。 菌株SRl經(jīng)常規(guī)生理生化及APIID32E系統(tǒng)鑒定為溶藻弧菌。在此基礎(chǔ)上，又對該菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，測定了其16S rRNA基因序列和熱激蛋白HSP60(Heat shock protein，HSP)基因序列。所擴(kuò)增的16S rRNA基因序列長度為1 43l bp，在GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的存取號為DQ269211，對菌株SRl16S rRNA基因序列

4、進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明菌株SRl與溶藻弧菌(AY967727)親緣關(guān)系最近，然而置信度較低，僅有27[％]，不能有效地鑒定到種。為進(jìn)一步確定其分類地位，測定了菌株SRl的HSP60基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到菌株SRl的HSP60基因部分序列長度為507bp，在GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的存取號為：DQ269210。HSP60基因序列分析表明，該菌株與溶藻弧菌(AF230931)同源性最高，為99.2[％]。系統(tǒng)發(fā)育樹表明SRL確與

5、溶藻弧菌(AF230931)聚為一個分支，且置信度較高，為84[％]。綜合上述結(jié)果，菌株SRl可鑒定為溶藻弧菌。 用菌株SRl的全菌免疫新西蘭白兔，發(fā)現(xiàn)SRl能有效地刺激新西蘭白兔產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生抗血清。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測得血清抗體效價為6 400。免疫熒光抗體技術(shù)(IFAT)檢測表明該血清與菌株SRl發(fā)生特異性結(jié)合，與副溶血弧菌和哈維氏弧菌發(fā)生交叉反應(yīng),與非弧菌屬細(xì)菌則沒有交叉。用十二烷基肌氨酸鈉(Sarko

6、syl)抽提結(jié)合超速離心純化的方法提取了菌株SRl的主要外膜蛋白(major outer membrane proteins,MOMPs),通過SDS-PAGE分析其主要外膜蛋白的組成結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,該溶藻弧菌的外膜蛋白帶有12條,其中有9條主要蛋白帶,分子量分別為106 kDa、73 kDa、66 kDa、51 kDa、48 kDa、45 kDa、39 kDa、36 kDa和32 kDa,另有3條不太明顯的條帶,分別為92 kDa、8

7、2 kDa和29 kDa;經(jīng)SDS-PAGE后,外膜蛋白與兔抗SR1全菌血清的Western-blot印跡顯示,12條蛋白帶中有6條發(fā)生了免疫反應(yīng),分子量分別為73 kDa、48 kDa、45 kDa.、39 kDa、36 kDa和32 kDa,說明可能與溶藻弧菌SR.1抗原的特異性和致病性有關(guān)。 通過SDS-PAGE圖譜分析比較了菌株SR1與5株弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株主要外膜蛋白的結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果表明,6株弧菌主要外膜蛋白的SDS-PAG

8、E圖譜各不相同,差異較大,但一般有6～12條蛋白條帶,分子量多集中在106～65 kDa和48～28 kDa之間,其中分子量為48 kDa和36 kDa的蛋白條帶為6株弧菌所共有。用兔抗SR1全菌血清進(jìn)行Western-blot印跡顯示,6株弧菌都能發(fā)生程度不等的陽性反應(yīng),反應(yīng)條帶的分子量集中在73～65 kDa、48～45 kDa和41～36 kDa之間,其中36 kDa的蛋白反應(yīng)帶為6株弧菌所共有。說明分子量36 kDa的外膜蛋白是

9、這6株弧菌的共同抗原,有可能作為制備弧菌外膜蛋白亞單位疫苗的候選材料。 為進(jìn)一步驗證分子量為36 kDa的外膜蛋白是弧菌特異性的外膜蛋白,分析比較了菌株SR1及另外11株弧菌與愛德華氏菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌的主要外膜蛋白組成結(jié)構(gòu)。通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),36 kDa的外膜蛋白為這12株弧菌所共有,而愛德華氏菌、熒光假單胞菌和大腸桿菌的SDS-PAGE圖譜則沒有36 kDa的蛋白條帶出現(xiàn),說明36 kDa的外膜蛋白有可能