60COγ射線照射對(duì)豚鼠耳蝸損傷及乙酰半胱氨酸輻射防護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段。在鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤患者的放射治療時(shí)，單側(cè)或雙側(cè)耳蝸受到相當(dāng)于腫瘤治療劑量的照射，引起放療后的感音神經(jīng)性耳聾(sensorineurial hearingloss，SNHL)的發(fā)生，在中國(guó)，鼻咽癌放療后SNHL的發(fā)生率可達(dá)36％，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放射治療所致的SNHL的發(fā)生發(fā)展規(guī)律仍不清楚，目前對(duì)放療后SNHL尚無(wú)有效的治療方法，給臨床治療工作帶來(lái)了很大的困擾。因此研究電

2、離輻射引起耳蝸損害的細(xì)胞分子機(jī)理，對(duì)于如何使用抗輻射損傷的藥物治療具有重要的臨床意義。本研究旨在通過(guò)建立60Coγ射線照射致豚鼠耳蝸損傷的模型，通過(guò)電生理、病理形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)染色、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dTP缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TU

3、NEL)等檢測(cè)技術(shù)，觀察豚鼠60Coγ射線照射后耳蝸損傷的改變，初步探討耳蝸損傷發(fā)生的可能分子機(jī)制，并局部經(jīng)圓窗膜給予抗氧化劑乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)以及觀察其對(duì)60Coγ射線照射后耳蝸損傷是否具有防護(hù)作用，為放射治療引起的SNHL的治療尋求安全有效的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:本研究分三部分:第一部分，60Coγ射線照射致豚鼠耳蝸損傷模型的建立;第二部分，60Coγ射線照射致豚鼠耳蝸細(xì)胞凋亡的相

4、關(guān)研究;第三部分，乙酰半胱氨酸在60Coγ射線照射引起的耳蝸損傷中的防護(hù)作用。
　　第一部分實(shí)驗(yàn)方法:48只白化豚鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和放療組，對(duì)照組8只為未進(jìn)行60Coγ射線照射的健康豚鼠，放療組40只，以右耳為照射耳，一次性給予耳顳部70Gy60Coγ射線照射，于照射后第1天、第4天、第7天、第14天、第30天行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)測(cè)聽(tīng)后處死動(dòng)物，取右側(cè)聽(tīng)泡固定，做耳蝸中軸

5、切片HE染色，每組隨機(jī)取2只耳蝸?zhàn)龌啄呙桦婄R(scanning electron microscope，SEM)檢查，觀察耳蝸組織的形態(tài)學(xué)病理變化。第二部分實(shí)驗(yàn)方法:白化豚鼠130只，分為對(duì)照組和放療組，對(duì)照組26只，為未進(jìn)行60Coγ射線照射的健康豚鼠，放療組104只，以右耳為照射耳，一次性給予耳顳部70Gy60Coγ射線照射，并于照射后第1天、4天、7天、14天處死豚鼠行以下相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè):①耳蝸超氧化物酶(superoxide

6、 dismulasc，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的檢測(cè)。②TUNEL法檢測(cè)耳蝸組織的細(xì)胞凋亡情況。③免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate specific proteases,Caspase)3、Caspase8、Caspase9的表達(dá)。④蛋白印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)耳蝸Caspase3、Caspase8、C

7、aspase9的表達(dá)。⑤RT-PCR檢測(cè)凋亡基因Bax、Bcl-2和Fas信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)的表達(dá)。第三部分實(shí)驗(yàn)方法:白化豚鼠144只，隨機(jī)分為4組，每組36只，四組分別為:正常組（未進(jìn)行任何干預(yù)的健康豚鼠）、單純放療組、生理鹽水組（放療+生理鹽水組）、乙酰半胱氨酸藥物組（放療+乙酰半胱氨酸組）。每組均取右耳為實(shí)驗(yàn)耳。除正常組外，其余3組均分別在照射后第4天、第14天行以下相關(guān)檢查:①ABR檢測(cè)。②耳蝸

8、SOD和MDA的檢測(cè)。③TUNEL法檢測(cè)耳蝸組織的細(xì)胞凋亡。④免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡蛋白Caspase3、Caspase8、Caspase9的表達(dá)。
　　結(jié)果:第一部分，①大體標(biāo)本觀察:70Gy劑量照射后第1天、第4天、第7天所有豚鼠聽(tīng)泡內(nèi)無(wú)積液及膿性分泌物，第14天少數(shù)豚鼠有中耳積液，照射后第30天的豚鼠右耳聽(tīng)泡內(nèi)均有積液或膿性分泌物。②ABR反應(yīng)閾值:照射后第1天ABR閾值(20.00±4.47 dB nHL)比對(duì)照組(11.

9、66±2.58 dB nHL)高，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，照射后第4天ABR閾值(25.00±10.48 dB nHL)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，照射后第7天(46.66±9.31 dB nHL)、第14天(55.00±5.47dB nHL) ABR閾值與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，照射后第30天由于豚鼠聽(tīng)泡內(nèi)有膿性分泌物，ABR閾值最高聲強(qiáng)105dB nHL引不出。③HE染色顯

10、示:對(duì)照組耳蝸組織結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)變性萎縮等異常改變，而放療組的豚鼠耳蝸組織結(jié)構(gòu)在照射后不同時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)了不同程度的損害，并隨著照射后觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，組織結(jié)構(gòu)損害更加嚴(yán)重。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(SGC)的損傷表現(xiàn)為:細(xì)胞萎縮（細(xì)胞漿的減少、細(xì)胞核濃縮凝集、缺失或者整個(gè)細(xì)胞的缺失）;照射后第1天出現(xiàn)細(xì)胞漿輕微萎縮，細(xì)胞核未見(jiàn)萎縮，第4天時(shí)部分細(xì)胞漿出現(xiàn)明顯萎縮，少數(shù)細(xì)胞核也呈現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，第7天、14天萎縮的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，第30天時(shí)可見(jiàn)細(xì)

11、胞萎縮程度加劇，甚至出現(xiàn)整個(gè)細(xì)胞的缺失，空泡形成。耳蝸螺旋器(Corti器)的表現(xiàn):對(duì)照組Corti器，3排外毛細(xì)胞及1排內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊。觀察放療組Corti器照射后第1天、第4天、第7天的結(jié)構(gòu)可見(jiàn):整個(gè)Corti形態(tài)未見(jiàn)明顯塌陷，3排外毛細(xì)胞及內(nèi)毛細(xì)胞排列尚整齊。照射后第14天、30天出現(xiàn)明顯的Corti器塌陷萎縮，有明顯外毛細(xì)胞缺失的現(xiàn)象。耳蝸血管紋(SV)的表現(xiàn):對(duì)照組血管紋結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)充血水腫空泡形成，放療組第1天、第4天血

12、管紋未見(jiàn)明顯病理改變，第7天、第14天可見(jiàn)輕微的水腫，第30天才出現(xiàn)明顯的的水腫或較多空泡形成。④基底膜掃描電鏡結(jié)果:掃描電鏡觀察可見(jiàn)，對(duì)照組耳蝸各回的內(nèi)毛細(xì)胞(inner haircell，OHC)、外毛細(xì)胞靜(outer hair cell，OHC)纖毛排列整齊、形態(tài)正常，OHC的靜纖毛呈V型，IHC靜纖毛略呈弓形。放療組可見(jiàn)不同程度的纖毛排列紊亂、倒伏、融合、殘缺甚至缺失，這種變化在第三排OHC比較明顯，并隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)，以

13、上變化更加突出。照射后第1天毛細(xì)胞纖毛無(wú)明顯倒伏缺失，部分第三排OHC纖毛排列紊亂、轉(zhuǎn)向，但是第4天第三排OHC纖毛排列轉(zhuǎn)向紊亂并出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，第7天時(shí)OHC纖毛出現(xiàn)紊亂融合和缺失，以第三排OHC明顯，IHC纖毛也出現(xiàn)紊亂或缺失。第14天時(shí)三排毛細(xì)胞纖毛均出現(xiàn)明顯融合和缺失現(xiàn)象。第30天時(shí)三排OHC出現(xiàn)大量的缺失，IHC纖毛排列紊亂，部分缺失。第二部分:①SOD活力和MDA水平的測(cè)定:對(duì)照組耳蝸SOD活力(41.61±26.49 U/m

14、gprot)較高，照射后第1天(14.08±2.90 U/mgprot)、第4天(11.83±2.74 U/mgprot)、第7天(11.30±2.98 U/mgprot)、第14天(8.70±1.29 U/mgprot)各不同時(shí)間點(diǎn)SOD活力與對(duì)照組比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD活力呈逐漸遞減趨勢(shì)。對(duì)照組耳蝸MDA含量(0.24±0.09 nmol/mgprot)較低，其與照射后第1天(0.

15、49±0.10 nmol/mgprot)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，照射后第4天(0.66±0.26nmol/mgprot)、7天(0.88±0.30 nmol/mgprot)、14天(0.84±0.13nmo l/mgprot)組與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。②Tunel檢測(cè)結(jié)果:光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)Tunel法使凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈亮棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，非凋亡細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。對(duì)照組SGC、Corti器、S

16、V均未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，放療組Corti器、血管紋未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞。SGC對(duì)照組未見(jiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)，而放療組可見(jiàn)明顯染成棕黃色的凋亡細(xì)胞，對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡比率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)照射后第1天(5.20±1.40％)與對(duì)照組(0.00±00％)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，放療后第4天(16.00±1.10％)、第7天(19.00±4.20％)、第14天(32.00±8.70％)與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。③免疫組織

17、化學(xué)染色結(jié)果顯示:Caspase3、Caspase8、Caspase9在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿的棕黃色顆粒，Caspase3、Caspase8、Caspase9在耳蝸組織中的陽(yáng)性表達(dá)在SGC中明顯，在Corti及血管紋中表達(dá)不明顯。SGC的Caspase8在照射后第1天(0.12±0.01)、第4天(0.23±0.04)、第7天(0.11±0.01)、14天(0.21±0.03)的平均光密度值與對(duì)照組(0.05±0.02)的

18、平均光密度值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。照射后第1天SGC的Caspase3平均光密度值(0.10±0.02)與對(duì)照組(0.07±0.01)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，照射后第4天(0.11±0.02)、第7天(0.14±0.01)、第14天(0.10±0.01)SGC的Caspase3平均光密度值與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，照射后第1天SGC的Caspase9平均光密度值(0.11±0

19、.01)與對(duì)照組(0.12±0.01)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，照射后第4天(0.22±0.03)、第7天(0.35±0.02)、第14天(0.29±0.02)SGC的Caspase9平均光密度值與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。④WB檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照組豚鼠耳蝸中可見(jiàn)少量Caspase3、8、9蛋白的表達(dá)，放療組可見(jiàn)Caspase3的表達(dá)上調(diào)，其中照射后1天的灰度值(0.59±0.09)與對(duì)照組(0.23±0

20、.07)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，照射后第4天(0.58±0.19)、14天(0.54±0.05)與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。放療組可見(jiàn)Caspase9的表達(dá)上調(diào)，其中照射后1天的灰度值(2.06±0.24)與對(duì)照組(0.46±0.09)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，照射后第4天(2.05±0.13)、14天(1.94±0.25)與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。照射后第1天

21、(0.68±0.09)、第4天(0.75±0.19)、第7天(0.95±0.25)的Caspase8灰度值與對(duì)照組(0.46±0.09)比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。⑤RT-PCR結(jié)果:對(duì)照組豚鼠耳蝸中可見(jiàn)少量Fas、Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)，放療組可見(jiàn)Fas mRNA表達(dá)上調(diào)，其中照射后第1天(2.13±1.23)與對(duì)照組(0.80±0.37)的灰度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，照射后第4天(2.92

22、±2.06)與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。照射后第1天(1.90±1.20)、第4天(1.81±1.54) BaxmRNA灰度值與對(duì)照組比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。照射后各不同時(shí)間Bc卜2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。第三部分:①ABR閾值測(cè)定:NAC藥物組（第4天組）(26.25±8.53 dBnHL)與單純放療組（第4天）(25.00±10.48 dBnHL)的AB

23、R閾值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，NAC藥物組（第14天組）(41.25±11.08 dBnHL)與單純放療組（第14天）(55.00±5.47 dBnHL)的ABR閾值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，正常組ABR閾值(11.66±2.58 dBnHL)較低，其與單純放療組（第4天、14天）ABR閾值比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。②掃描電鏡發(fā)現(xiàn):正常組內(nèi)外毛細(xì)胞排列整齊，外毛細(xì)胞纖毛呈V型，內(nèi)毛細(xì)胞

24、纖毛略呈弓形。4天組中單純放療組、生理鹽水組第三排外毛細(xì)胞纖毛排列紊亂，并出現(xiàn)缺失，而NAC藥物組毛細(xì)胞纖毛無(wú)明顯缺失及倒伏。14天組中單純放療組和生理鹽水組外毛細(xì)胞纖毛倒伏變形或缺失，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛無(wú)明顯缺失，部分倒伏，而NAC藥物組外毛細(xì)胞纖毛無(wú)明顯缺失，排列稍紊亂，內(nèi)毛細(xì)胞纖毛有部分倒伏。③SOD活力和MDA含量的測(cè)定: NAC藥物組（第4天）(17.27±3.80 U/mgprot)的SOD活力與單純放療組（第4天）(11.84±

25、2.74 U/mgprot)的SOD活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，NAC藥物組（第14天）(10.65±2.95 U/mgprot)的SOD活力與單純放療組（第14天）(8.70±1.29 U/mgprot)的SOD活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，正常組耳蝸SOD活力(41.61±26.49U/mgprot)較高，其與單純放療組（第4天、14天）的SOD活力比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。NAC藥物組

26、（第4天）(0.40±0.20nmol/mgprot)的MDA水平與單純放療組（第4天）(0.66±0.26 nmol/mgprot)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，NAC藥物組（第14天）(0.33±0.05nmol/mgprot)與單純放療組（第14天）(0.84±0.13 nmol/mgprot)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，正常組耳蝸MDA含量(0.24±0.09nmol/mgprot)較低，其MDA含量與單純放療

27、組（第4天、14天）比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。④免疫組織化學(xué)染色:NAC藥物組（第4天）(0.12±0.02)與單純放療組（第4天）(0.23±0.04)的Caspase8平均光密度值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，NAC藥物組（第4天）(0.09±0.01)與單純放療組（第4天）(0.11±0.02)的Caspase3平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，NAC藥物組（第4天）(0.18±0

28、.01)與單純放療組（第4天）(0.22±0.03)的Caspase9平均光密度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。NAC藥物組（第14天）(0.09±0.03)與單純放療組（第14天）(0.21±0.03)的Caspase8平均光密度值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，NAC藥物組（第14天）(0.08±0.02)與單純放療組（第14天）(0.10±0.01)的Caspase3平均光密度值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜

29、0.01)，NAC藥物組（第14天）(0.21±0.02)與單純放療組（第14天）(0.29±0.02)的Caspase9平均光密度值比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。生理鹽水組（第4天，第14天）與單純放療組的Caspase3、Caspase8、Caspase9平均光密度值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（第4天，第14天）(p＞0.05)。⑤TUNEL染色:正常組的耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞未見(jiàn)明顯棕黃色的凋亡細(xì)胞，而單純放療組和生理鹽水組

30、可見(jiàn)較多凋亡細(xì)胞，NAC藥物組的凋亡細(xì)胞數(shù)比單純放療組和生理鹽水組少，NAC藥物組（第4天）(6.40±1.80％)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡比率與單純放療組（第4天）(16.00±1.10％)的凋亡比率比較差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。NAC藥物組（第14天）(7.80±1.79％)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡比率與單純放療組（第14天）(32.00±8.70％)的凋亡比率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。單純放療組（第4天、14天）

31、與生理鹽水組（第4天、14天）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.70Gy的60COγ射線照射豚鼠耳顳部后，能引起聽(tīng)力及耳蝸組織結(jié)構(gòu)的損傷，隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)，其損害更明顯，成功建立了60CO照射后耳蝸損傷模型。
　　2.60COγ射線照射可致豚鼠耳蝸SOD活力下降，MDA水平升高。
　　3.60COγ射線照射后可引起凋亡基因Fas及BaxmRNA表達(dá)上調(diào)，凋亡蛋白Caspase3、8、9表達(dá)也上調(diào)。<