腦鈉肽單克隆抗體的制備及初步臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的：心功能衰竭的早期診斷與干預(yù)在心臟疾患的診治中非常重要。腦鈉肽(BNP)作為一種主要來源于心室肌細(xì)胞的循環(huán)激素，在心室壁張力升高時迅速、大量分泌，其血漿濃度與心功能的相關(guān)性已被廣泛認(rèn)識。但目前國內(nèi)檢測BNP濃度靠進(jìn)口國外的各種不同試劑盒，每種試劑盒檢測范圍及參考值不同，結(jié)果亦不盡相同，缺乏可比性，且價格昂貴。為使BNP檢測國產(chǎn)化，本研究制備了BNP單克隆抗體，初步用于正常人及心臟病患者的血漿BNP濃度檢測，以評價自制BNP單抗檢測所

2、得的BNP濃度與心功能的關(guān)系，為進(jìn)一步研制國產(chǎn)BNP單抗試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.根據(jù)GenBank中檢索到的人BNP成熟蛋白序列，拼接BNP的基因。以原核表達(dá)系統(tǒng)pET32構(gòu)建pET32a.BNP重組質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)提取純化，制備人Trx-BNP融合蛋白。 2.以Trx-BNP融合蛋白作抗原，免疫小鼠，獲得分泌BNP抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔，進(jìn)行BNP單克隆抗體的大量制備。檢測雜交瘤細(xì)胞的

3、培養(yǎng)上清抗體效價及腹水抗體效價。以Westernblot及免疫組化檢測制備的BNP抗體特異性。 3.用制備的BNP單克隆抗體以ELISA間接法檢測正常人及各級心功能的心臟病患者的血漿BNP濃度。正常人20例，心臟病患者92例，后者按紐約心臟病學(xué)會(NYHA)心功能分級分為：心功能Ⅰ級(24例)、Ⅱ級(23例)、Ⅲ級(20例)、Ⅳ級(25例)，同時經(jīng)超聲心動圖評價心臟收縮(EF值)及舒張功能(E/A值)。將心臟功能與BNP濃度作相

4、關(guān)性分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果： 1.利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET32成功構(gòu)建了pET32a.BNP重組質(zhì)粒，并制備出高純度的人Trx-BNP融合蛋白。 2.以Trx-BNP融合蛋白作抗原成功制備BNP單克隆抗體。抗體效價高，特異性強(qiáng)。 3.用制備的BNP單克隆抗體以ELISA間接法測定人血漿BNP濃度。BNP濃度與心功能有較好的相關(guān)性。隨著心功能的惡化，BNP濃度逐漸升高。BNP濃度在各級心功能中的變化