煙蚜繭蜂滯育關(guān)聯(lián)基因表達(dá)及肌鈣蛋白C基因的克隆.pdf

1、煙蚜繭蜂Aphidius gifuensis Ashmead是一種優(yōu)良的內(nèi)寄生性天敵昆蟲，可有效控制桃蚜等多種蚜蟲危害。但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，存在生產(chǎn)周期長、貯存時(shí)間短、供求脫節(jié)等問題，使得天敵產(chǎn)品難以在害蟲爆發(fā)時(shí)發(fā)揮最大作用。滯育能通過特定基因表達(dá)模式為昆蟲提供可選擇性的發(fā)育途徑，使滯育個(gè)體產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)積累、新陳代謝抑制、生長發(fā)育減緩或停滯等表型，還可提高其對低溫、干旱等逆境抗性。這一特性在煙蚜繭蜂擴(kuò)繁應(yīng)用中具有重要作用，不僅能提升子代

2、煙蚜繭蜂的適應(yīng)能力和寄生能力，而且能顯著延長天敵產(chǎn)品的貨架期，促進(jìn)煙蚜繭蜂的大規(guī)模擴(kuò)繁和應(yīng)用。近年來，煙蚜繭蜂滯育的環(huán)境調(diào)控、生理生化機(jī)制等已有深入研究，但其滯育的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。
　　基于此，本研究以煙蚜繭蜂為研究對象，測定了正常發(fā)育、滯育和滯育解除個(gè)體的轉(zhuǎn)錄組全序列，改進(jìn)了以往僅對正常組和處理組進(jìn)行分析的常規(guī)做法;分析比較了三組測序結(jié)果，獲得大量差異表達(dá)基因，篩選出了僅在滯育期間特異表達(dá)的滯育關(guān)聯(lián)基因;測定了9個(gè)候選基因

3、的相對表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證了測序結(jié)果的可靠性;克隆了滯育關(guān)聯(lián)基因肌鈣蛋白C基因全長cDNA序列，并對其序列進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，為后續(xù)進(jìn)行滯育關(guān)聯(lián)基因的功能驗(yàn)證及深入研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.研究了不同發(fā)育狀態(tài)煙蚜繭蜂的轉(zhuǎn)錄組特征。通過對煙蚜繭蜂正常發(fā)育、滯育及滯育解除個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及分析，獲得unigene47，077個(gè)，平均長度為868 bp，注釋率61.4％。經(jīng)兩兩比較，篩選出滯育-正常發(fā)育差異表達(dá)

4、基因458個(gè)，滯育解除-滯育差異表達(dá)基因298個(gè)，滯育解除-正常發(fā)育差異表達(dá)基因806個(gè)。差異表達(dá)基因的GO功能富集分析表明3組DEG顯著富集條目交集有17個(gè)，其中“structural constituent of cuticle”富集最顯著;KEGG通路富集分析表明“Cardiac muscle contraction”和“Antigen processing and presentation”顯著富集。蛋白組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯

5、示有2，245個(gè)蛋白相關(guān)聯(lián)，差異蛋白共157個(gè)，其中99個(gè)表達(dá)趨勢一致，表現(xiàn)出很好的關(guān)聯(lián)性。
　　2.分析了煙蚜繭蜂滯育關(guān)聯(lián)基因的種類與功能。深入分析上述比對結(jié)果，挖掘出滯育關(guān)聯(lián)基因59個(gè)，注釋到46個(gè)，其主要功能涉及耐寒性、自身免疫防御、脂類代謝、表皮蛋白代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。根據(jù)已有研究篩選出9個(gè)滯育關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了測序結(jié)果的可靠性。
　　3.克隆了重要的滯育關(guān)聯(lián)基因

6、。肌鈣蛋白C通過結(jié)合Ca2+而發(fā)揮其生物學(xué)功能，不僅能調(diào)節(jié)肌肉活動(dòng)，還可通過對肌動(dòng)蛋白的作用，間接調(diào)控細(xì)胞骨架系統(tǒng)。利用RACE技術(shù)克隆AgTnC基因的cDNA全長序列，該基因全長703 bp，包括一個(gè)462 bp的開放閱讀框，編碼153個(gè)氨基酸。功能域預(yù)測和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其存在一段高度保守序列DXDXSX6E，該序列是EF-hand家族蛋白的特征性區(qū)域。煙蚜繭蜂AgTnC基因在滯育期間顯著上調(diào)表達(dá)，推測其可能與增強(qiáng)肌肉細(xì)胞骨架可塑