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文檔簡介
1、轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉在我國應(yīng)用最廣,它對鱗翅目害蟲具有較強(qiáng)的抗性。利用基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入棉花中的Bt基因可以在棉花各組織器官中高效表達(dá),合成對鱗翅目害蟲具有高效毒殺作用的Bt蛋白。但若在生產(chǎn)上仍用常規(guī)栽培管理法,品種的產(chǎn)量潛力就不能正常發(fā)揮,甚至在不同的生態(tài)棉區(qū)造成產(chǎn)量顯著降低。本文以市售Bt殺蟲粉劑為原料,純化、結(jié)晶出高純度的Bt晶體蛋白,依此得到Bt蛋白抗體,制備出Bt蛋白試劑盒,并對轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉與常規(guī)非抗蟲棉進(jìn)行了棉花在不同時空的抗
2、蟲性研究,旨在為抗蟲棉的檢測提供快速、有效的檢測方法,并為抗蟲棉的田間管理提供理論基礎(chǔ)。其研究結(jié)果如下: 1.以市售的Bt蛋白粉劑為原料,采用堿解、層析和乙醇沉淀的生物化學(xué)的方法提取純化Bt晶體蛋白。結(jié)果表明,在pH10.5時,堿解程度最高,采用60%飽和度的硫酸銨沉淀可以去除大多數(shù)的多糖,G-50層析柱將Bt蛋白(130KD)與其他蛋白分開,上清用1.2-1.5倍的95%乙醇沉淀,即可得到晶體狀Bt蛋白,凍干稱重,得率為1.3
3、38g/KgBt蛋白粉劑??捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白純度為91%,SDS-PAGE測定晶體蛋白的分子量為130KD。 2.采用實驗室飼養(yǎng)棉鈴蟲的方法,棉鈴蟲的初孵蟲、一鈴蟲、二鈴蟲48小時的死亡率為100%,三鈴蟲48小時的死亡率為88%,四鈴蟲48小時的死亡率為76%,生物活性達(dá)18000IU/mg。 3.實驗用2Kg重的新西蘭大白兔,采用免疫學(xué)制備抗體的方法,由兔血清以飽和硫酸銨沉淀提取蛋白,再以A-50層析后,加冷的95
4、%乙醇沉淀制備抗體,所得抗體的滴度為32(瓊脂凝膠擴(kuò)散法),完全可作為試劑盒使用(要求滴度不低于16)。 4.所制備的Bt蛋白試劑盒與進(jìn)口的Agdia試劑盒做實驗對比,結(jié)果表明:自制試劑盒Bt蛋白濃度線性范圍為1750~28000ng·ml-1,而Agdia試劑盒Bt蛋白濃度線性范圍為2250~36000ng·ml-1,可見自制試劑盒檢測靈敏度比Agdia試劑盒的檢測靈敏度稍高,但檢測范圍比Agdia試劑盒稍窄。自制試劑盒的精確
5、度稍差,穩(wěn)定性不是很好,有待進(jìn)一步實驗探索。 5.對轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉與非抗蟲棉在不同時間和不同的器官進(jìn)行取樣,用自制的Bt蛋白試劑盒檢測(棉花葉取主干莖葉),結(jié)果顯示,同一時期,同一棉株上,倒1葉Bt毒蛋白含量較低,倒2葉較高,倒3葉最高,而倒5葉較倒3、4葉又有所下降,表明Bt基因在葉片中的表達(dá)產(chǎn)物隨葉齡的變化而變化。在不同的生長時期,隨著幼苗的生長,Bt蛋白的表達(dá)量也隨之增加,均可達(dá)到抗蟲的最低限度,特別是蕾期和結(jié)鈴期,棉花
6、葉中的Bt蛋白含量最高,但到吐絮期以后,Bt蛋白的表達(dá)量逐漸降低,棉花葉中的Bt蛋白含量最低,已經(jīng)低于抗蟲所要求的最低限度,不同生長時期棉花葉Bt蛋白表達(dá)趨勢為:初花期>蕾期>花鈴期>苗期>吐絮期。9種組織對棉鈴蟲初孵幼蟲的抗性順序為:功能葉>嫩葉>幼蕾>幼鈴>幼葉>花瓣>花蕊>苞葉>老葉。 6.同一位置不同時期的棉花葉子(倒2葉,完全展開功能葉),經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示:抗蟲棉在生長初期,棉花葉子中Bt蛋白的表達(dá)就開始活躍,
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