急性損傷對(duì)鼠視網(wǎng)膜谷氨酰胺合成酶的影響及地塞米松干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的: 谷氨酸是整個(gè)中樞神經(jīng)包括視網(wǎng)膜中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，高濃度的谷氨酸可以對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生興奮性毒性作用，因此視網(wǎng)膜中谷氨酸代謝的有效調(diào)控對(duì)于維持正常的視網(wǎng)膜功能非常重要。谷氨酸神經(jīng)傳輸?shù)慕K止滅活是靠表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體將細(xì)胞胞外的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，但在谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)中，起限速酶作用的是谷氨酰胺合成酶(GlutamineSynthetase，GS)。正常情況下視網(wǎng)膜細(xì)胞外谷氨酸的

2、攝取主要由Müller細(xì)胞完成。有研究發(fā)現(xiàn)GS在視網(wǎng)膜中只表達(dá)于MUller細(xì)胞。GS影響著Müller細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的功能，只有GS把谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，降低了細(xì)胞內(nèi)谷氨酸的濃度后，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的功能才得以正常進(jìn)行。所以，病理狀態(tài)下GS表達(dá)量降低、活性下降必將造成細(xì)胞外液谷氨酸濃度的升高，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷?；诖?，從降低谷氨酸濃度來保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的角度考慮，研究GS的基因表達(dá)和變化是探討視神經(jīng)保護(hù)的極其重要

3、一環(huán)，也為揭示青光眼視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷機(jī)制及探討新的保護(hù)治療方法提供依據(jù)。 在以前的研究中，李樹寧博士通過大鼠Müller細(xì)胞的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)高壓力狀態(tài)下GSmRNA表達(dá)下降。閆桂剛博士通過靜脈燒灼法建立慢性高眼壓模型，發(fā)現(xiàn)高眼壓狀態(tài)下GSmRNA表達(dá)量和酶活性低于對(duì)照組(P<0.05)。證明了慢性高眼壓狀態(tài)下體內(nèi)Müller細(xì)胞代謝谷氨酸的能力降低。目前有關(guān)急性高眼壓造成視網(wǎng)膜急性損傷后GS表達(dá)變化的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠視網(wǎng)膜

4、急性損傷的高眼壓模型對(duì)GS基因表達(dá)及酶活性變化進(jìn)行了研究，探討了其變化規(guī)律及調(diào)控機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)表明糖皮質(zhì)激素可調(diào)節(jié)GS的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中我們也觀察了地塞米松干預(yù)后大鼠視網(wǎng)膜GS基因表達(dá)及酶活性的變化。 材料和方法: 健康Wistar大鼠126只(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄兼用，體重200-250g，實(shí)驗(yàn)前測(cè)量并記錄眼壓。其中6只大鼠于眼壓升高結(jié)束后2周處死取其眼球，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色并觀察視網(wǎng)膜厚度的

5、改變。 余120只大鼠分成B、C兩組，B組，60只，用于GSmRNA及酶活性的測(cè)定，C組，60只，用于GS蛋白表達(dá)量的測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)中以RT-PCR半定量GSmRNA，以分光光度計(jì)測(cè)定GS酶活性，以Western blot法測(cè)定GS蛋白表達(dá)量。 B組中，60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(B<,1>)、穿刺組(B<,2>)、加壓組(B<,3>)、加壓+地塞米松注射組(B4)。B<,1>組5只大鼠處死后取左眼用于實(shí)驗(yàn)對(duì)照。B<,2>組

6、5只大鼠，以左眼為穿刺眼，輸液瓶液面高于角膜頂點(diǎn)15cm，于術(shù)后24h時(shí)間處死。B<,3>組25只，以左眼為實(shí)驗(yàn)眼。B<,4>組25只大鼠，以左眼為實(shí)驗(yàn)眼，加壓結(jié)束即刻腹腔注射地塞米松0.5mg/kg。B<,3>組和B<,4>組大鼠在加壓結(jié)束后4h、12h、24h、36h、72h時(shí)間點(diǎn)處死，各時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。 C組再分組同B組，分別為C<,1>、C<,2>、C<,3>、C<,4>(見附表1)。 高眼壓模型采用前房灌注加壓法：10

7、％水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠頭部固定在操作臺(tái)上，暴露左眼。將灌注液生理鹽水瓶懸置于液平面至大鼠左眼角膜頂點(diǎn)垂直距離150cm(壓力約110mmHg，lmmHg=0.133kPa)處。帶側(cè)孔的5號(hào)針針尖自內(nèi)眥角膜緣內(nèi)1.5mm處刺入，平行推進(jìn)，由外眥角膜緣內(nèi)穿出，調(diào)整針體側(cè)孔位于瞳孔區(qū)。加壓持續(xù)60min。 結(jié)果: 1.第一章 加壓結(jié)束后2周，大鼠角膜透明，瞳孔圓，晶體無混濁。標(biāo)本經(jīng)HE染色觀察，實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜厚度

8、較對(duì)照組變薄(P<0.05)。 2.第二章 ①穿刺組， GSmRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 ②加壓組 GSmRNA表達(dá)量4h即開始升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，24h達(dá)高峰(P<0.01)，36h時(shí)開始下降(P<0.01)，72h恢復(fù)正常水平(P>0.05)。 ③加壓+地塞米松，GSmRNA表達(dá)量4h開始升高，與對(duì)照組及加壓組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

9、05)；與加壓組比較，12h(P<0.05)，24h(P<0.01)，36h(P<0.05)；72h時(shí)與對(duì)照組及加壓組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.第三章 ①穿刺組， GS蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)②加壓組，GS蛋白表達(dá)量在術(shù)后12h開始升高，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 24h達(dá)高峰(P<0.05)，36h仍高(P<0.05)， 72h恢復(fù)正常水平(P>0.0

10、5)③加壓+地塞米松注射組，GS蛋白表達(dá)量術(shù)后12h時(shí)升高，但與加壓組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，24h達(dá)高峰(P<0.05)，36h仍高(P<0.05)，72h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4.第四章 ①穿刺組， GS酶活性與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 ②加壓組，GS酶活性在術(shù)后4h明顯下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，12h時(shí)仍低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P<0.01)，24h時(shí)(P>0.05)，36h時(shí)升達(dá)高峰(P<0.05)，72h恢復(fù)正常水平(P>0.05)。 ③加壓+地塞米松注射組，GS酶活性術(shù)后4h降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與加壓組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，12h水平仍較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但較加壓組高(P<0.05)，24h至36h時(shí)維持高峰狀態(tài)，24h水平與加壓組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，36

12、h水平與加壓組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，72h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1.本實(shí)驗(yàn)以前房灌注加壓法獲得了成本低、可重復(fù)性好的急性高眼壓動(dòng)物模型，保證了實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。 2.大鼠視網(wǎng)膜急性損傷后GSmRNA水平有一個(gè)明顯的升高過程，最高表達(dá)量升至正常的1.73倍。地塞米松可促使其表達(dá)，最高表達(dá)量達(dá)正常的2.10倍。 3.大鼠視網(wǎng)膜急性損傷后GS蛋白表達(dá)量也呈現(xiàn)升高，最高表達(dá)量升至