根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化篩選漆酶高產(chǎn)突變株.pdf

1、漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，由于自身特殊的催化性質(zhì)，在造紙工業(yè)、食品工業(yè)、生物合成領(lǐng)域和生物修復(fù)等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。平菇(Pleurotus ostreatus)學(xué)名側(cè)耳，是一種白腐真菌，可以合成包括漆酶在內(nèi)的多種木質(zhì)纖維素降解酶，是目前研究較多的漆酶產(chǎn)生菌之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行基因改造，以滿足工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，成為現(xiàn)代生物技術(shù)研究和應(yīng)用的重要手段。本文利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建突變株，篩

2、選漆酶高產(chǎn)菌，為提高漆酶的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。
　　對(duì)不同來(lái)源平菇菌株的漆酶合成能力進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示，在普通PDA培養(yǎng)基中4種菌株的漆酶活性基本無(wú)差異，但在培養(yǎng)基中添加銅離子和酵母粉兩種誘導(dǎo)物質(zhì)后，發(fā)酵液中的漆酶活性出現(xiàn)差異，添加銅離子對(duì)平菇5號(hào)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，在培養(yǎng)至第6天，漆酶活性達(dá)329.78U/mL，酵母粉對(duì)平菇4號(hào)和平菇5號(hào)均具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，發(fā)酵液中漆酶活性最大值分別為613.98 U/mL和783.61 U/mL。

3、綜合考慮漆酶活性以及菌體生長(zhǎng)等因素，選擇平菇5號(hào)作為出發(fā)菌株。
　　目前利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大型真菌均以子實(shí)體菌褶為受體，但子實(shí)體存在取材受時(shí)間限制較大的問(wèn)題，栽培周期長(zhǎng)，管理費(fèi)時(shí)。因此我們嘗試建立一種以菌絲體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化方法-嵌套平板法。此方法操作簡(jiǎn)單，周期短，可獲得轉(zhuǎn)化子。對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化結(jié)果為：根癌農(nóng)桿菌菌液的最適濃度OD600=0.6~0.7，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加200μmol/L AS，25℃共培養(yǎng)3~5 d。

4、　　通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法對(duì)平菇菌絲進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到了大量的轉(zhuǎn)化子。利用漆酶與ABTS反應(yīng)顯色的方法進(jìn)行初篩，再通過(guò)搖瓶復(fù)篩得到4株突變株。在液體培養(yǎng)條件下，對(duì)4株突變株產(chǎn)漆酶能力進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，與出發(fā)菌株相比，在普通PDA培養(yǎng)基中，4株突變株漆酶合成量均有不同程度的增加，其中突4和突6漆酶合成量增加幅度較大，漆酶合成量達(dá)到對(duì)照的2倍。在培養(yǎng)基中添加1 mmol/L銅離子，突7漆酶活性增加較大，在培養(yǎng)第16天漆酶活性達(dá)到10