γH2AX對膠質(zhì)瘤放射敏感性預(yù)測效果的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:神經(jīng)膠質(zhì)瘤為顱內(nèi)常見腫瘤，為預(yù)后較差的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，具有浸潤性生長和邊界不清等生物學(xué)特點(diǎn)，手術(shù)難以徹底切除。術(shù)后放射治療是膠質(zhì)瘤綜合治療中較為重要的手段。但是惡性膠質(zhì)瘤具有放射抗性致其放射治療效果欠佳，近來多個(gè)研究證實(shí)γH2AX逐漸成為檢測DNA雙鏈斷裂的一項(xiàng)新型生物學(xué)標(biāo)志。在本研究中，我們通過體外培養(yǎng)高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87、U251和LN229)，研究其放射敏感性以及經(jīng)X射線照射后三種細(xì)胞株γH2AX蛋白的表達(dá)變化，并

2、分析γH2AX蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性之間的相互關(guān)系。
　　方法:
　　1.選擇高級別人腦膠質(zhì)瘤U87、U251和LN229細(xì)胞株，分成0Gy組、2Gy組、4Gy組、6Gy組、8Gy組和10Gy組，經(jīng)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)后，行X線照射，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)2周左后，經(jīng)固定、染色后鏡下檢測細(xì)胞集落數(shù)，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率、細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，并繪制細(xì)胞存活曲線、由生物學(xué)參數(shù)比較細(xì)胞系間放射敏感性;
　　2.選擇高級別人腦膠質(zhì)瘤U

3、87、U251和LN229細(xì)胞株，按照經(jīng)X線照射后培養(yǎng)的時(shí)間分為0h組、0.5h組、1h組、2h組、6h組、12h組、24h組、36h組和48h組，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶約75％體積時(shí)，行2Gy照射，然后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0h、0.5h、1h、2h、6h、12h、24h、36h和48h，依次分別提取制備細(xì)胞總蛋白，經(jīng)蛋白變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜、封閉、Ⅰ抗反應(yīng)、Ⅱ抗孵育后，ECL化學(xué)發(fā)

4、光試劑盒顯影。采用Alpha Innotech凝膠成像儀檢測結(jié)果，Image J計(jì)算各電泳條帶平均光密度值，從而檢測其γH2AX蛋白表達(dá)變化。目的蛋白質(zhì)相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/同一樣本內(nèi)參灰度值。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析γH2AX蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性之間的相關(guān)性。以Western blotting條帶中6h組與0.5h組的蛋白表達(dá)量差值代表相對衰減速度，以目的蛋白質(zhì)峰值與初始值之間差值代表目的蛋白升高程度，分別與放射增敏

5、比行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，隨著X線照射劑量的增加，膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)逐漸降低，細(xì)胞克隆形成率減少，U87、LN229、U251細(xì)胞的放射增敏比(SER)依次為1.31±0.04、1.14±0.02、1.00±0.00，并采用單因素方差分析得出:放射增敏比(SER)自高至低依次為U87、LN229、U251（均P=0.000）;
　　2.Western blotting法顯示，隨著經(jīng)X線

6、照射后培養(yǎng)時(shí)間的延長，各膠質(zhì)瘤細(xì)胞系γH2AX蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的時(shí)間效應(yīng)曲線，U87、LN229和U251細(xì)胞株出現(xiàn)峰值時(shí)間依次為2h、1h和1h(P=0.000、0.000、0.015)。
　　3.γH2AX蛋白相對衰減速度和γH2AX升高程度均與放射增敏比呈正相關(guān)。(r=0.733, p=0.025;r=0.672,P=0.047)。
　　結(jié)論:
　　1.三種高級別人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株放射敏感性自高至低依次為