HMGB1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及初步分子機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：
　　1973年，一組在電泳下具有高遷移率的非組蛋白核蛋白被發(fā)現(xiàn)并且被命名為高遷移率族（high-mobility group HMG）蛋白，高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein HMGB1）是其中含量最豐富并且研究最充分的HMG蛋白。HMGB1在多種人類疾病中，尤其是在腫瘤及炎癥性疾病中扮演重要角色。HMGB1在胞內(nèi)不僅是DNA分子伴侶、染色體監(jiān)管者、細(xì)胞自噬維持者、凋亡

2、細(xì)胞的保護(hù)者，并且在細(xì)胞外 HMGB1可以發(fā)揮細(xì)胞因子，趨化因子和生長(zhǎng)因子活性，參與炎癥和免疫應(yīng)答反應(yīng)。HMGB1功能缺陷與腫瘤演進(jìn)的每一種標(biāo)志均相關(guān)，并且在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮作用。HMGB1的這些特征使其成為腫瘤研究中的重要分子靶點(diǎn)。盡管如此，目前在胃癌中HMGB1的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制仍知之甚少。
　　目的：
　　檢測(cè)慢病毒載體干擾HMGB1表達(dá)后，胃癌細(xì)胞系SGC-7901的生物學(xué)活性，利用基因芯片技術(shù)篩選潛在下

3、游作用因子，并進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證。
　　方法：
　　針對(duì)4個(gè)HMGB1靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)特異性干擾shRNA小分子（HMGB1-shRNA1，HMGB1-shRNA2，HMGB1-shRNA3，HMGB1-shRNA4），分別構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染載體GV115-HMGB1-KD1（KD1）、GV115-HMGB1-KD2（KD2）、GV115-HMGB1-KD3（KD3）、GV115-HMGB1-KD4（KD4），

4、并構(gòu)建陰性對(duì)照載體GV115-HMGB1-NC（NC）。分別通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞。RT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HMGB1的表達(dá)。胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為通過下述實(shí)驗(yàn)方法分析：MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆數(shù)，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移。用敲減組及陰性病毒對(duì)照組通過基因芯片技術(shù)探索下游基因。選擇下游信號(hào)通路并進(jìn)行進(jìn)一步分析

5、。
　　結(jié)果：
　　RT-PCR示KD1、KD2、KD4顯著抑制HMGB1的表達(dá)（>75％），KD2組抑制效率最高。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)相對(duì)于陰性病毒對(duì)照組（NC）和空白細(xì)胞對(duì)照組（CON），KD2組HMGB1表達(dá)顯著抑制(P<0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)和BrdU實(shí)驗(yàn)證實(shí)了與CON組和NC組相比，KD2組顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)示KD2組較NC組細(xì)胞克隆數(shù)減少(P<0.05)。 Transwel

6、l實(shí)驗(yàn)顯示KD2組相對(duì)CON組和NC組細(xì)胞遷移率受到顯著抑制(P<0.05)。相對(duì)NC組，KD2組的細(xì)胞凋亡率顯著增加。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了KD2組的S期細(xì)胞較NC組細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)?；蛐酒治鲎C實(shí)了通過抑制HMGB1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)778種基因上調(diào)，587種基因下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明HMGB1可能在胃癌細(xì)胞中通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路中的 RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9（JNK2）等因